NJA-1菌产环氧化物水解酶条件的优化及对脱氧雪腐镰刀菌烯醇生物转化的研究

论文摘要

真菌毒素是由真菌或霉菌产生的有毒次级代谢产物,广泛污染各种饲料原料和成品饲料。动物误食被真菌毒素污染的饲料会造成动物的真菌毒素中毒。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalnol,缩写DON）又称呕吐毒素（vomitoxin）,属单端孢霉烯族B族化合物,是镰刀菌产生的一种真菌毒素,主要污染谷物及其制品。在自然界中广泛存在,目前被认为是存在于赤霉病小麦中的主要天然毒素之一。最新研究发现,酶可通过将这些霉菌毒素的分子分解为无害的代谢物而将毒素的毒性去除。而环氧酶则可分解单端孢霉烯族菌毒素分子中的环氧基团。这些酶可以降解真菌毒素的代谢物或改变它们的分子结构来产生更少的毒素或者是那些可以代谢或吸收无害的成分。本论文主要研究在于优化NJA-1菌产环氧化物水解酶的条件,初步研究环氧化物水解酶的酶学性质并且生物转化DON。试验ⅠNJA-1菌产环氧化物水解酶条件的优化本实验室从土壤中分离得到一株NAJ-1菌株。本章实验主要是通过研究碳源、氮源、金属离子等培养基细分,以及pH、温度、装液量、添加诱导物等因素对菌株产酶的影响,优化产环氧化物水解酶的条件。实验结果表明:在本实验条件下此菌培养的最佳碳氮源组成是1%葡萄糖,1%玉米浆,培养基的初始pH为4.0,培养的最佳温度和时间是30℃下培养32h,低浓度底物苯基环氧乙烷对该酶具有诱导作用,培养基中的金属离子Ca2+、Mg2+对产酶有促进作用。试验Ⅱ环氧化物水解酶性质的初步研究本试验主要是利用NJA-1菌制备EH初酶液。并且用制备的初酶液进行环氧化物水解酶（EH）酶学性质的初步研究。试验结果表明,EH的最适反应温度是30℃,最适pH是pH 7.0;25-40℃范围内酶具有较好的热稳定性,pH 6.5-8.0范围内酶的稳定性较佳,Mg2+、Ca2+离子可促进酶活,有机溶剂DMSO可轻微促进EH酶活。试验Ⅲ菌体及初酶液对DON的转化本实验采用菌体及制备的初酶液和EH酶液,加入不同浓度的DON（浓度分别为:4μg/mL,8μg/mL,20μg/mL,100μg/mL）,30℃反应不同时间,用高效液相色谱（HPLC）测定DON的含量。结果表明:相比于未优化菌体,优化菌体其对DON转化率增加11.2%;初酶液可显著生物转化DON,转化率可达70～80%;初酶液和EH酶液都可生物转化DON为几种不同的物质,其出峰时间及数量基本相同。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 中英文缩略词
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性及其去毒
• 1 真菌毒素的分类
• 2 DON毒素的产生
• 3 DON的毒性
• 3.1 DON的急性毒性
• 3.2 DON的致呕吐作用
• 3.3 DON的皮肤毒性
• 3.4 慢性毒性
• 3.5 三致（致癌、致畸、致毒性）毒性
• 3.6 细胞毒性
• 3.7 DON的遗传毒性
• 3.8 DON的免疫毒性
• 3.9 DON与其它毒素的协同作用
• 4 DON的代谢及去毒的研究
• 4.1 DON的去毒
• 4.1.1 物理去毒法
• 4.1.2 化学去毒法
• 4.1.3 生物去毒法
• 4.2 DON毒性机理
• 4.3 DON的代谢特征
• 5 真菌毒素的预防
• 参考文献
• 第二篇 试验部分
• 第二章 NJA-1菌产环氧化物水解酶条件的优化
• 摘要
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 培养基的配制
• 2.2 菌体培养及菌体悬浮液制备
• 2.3 酶活力测定
• 2.4 生物量的测定
• 3 结果
• 3.1 酶标法测定酶活力
• 3.2 菌体悬浮液不同稀释倍数对OD值的影响
• 3.3 NJA-1菌产环氧化物水解酶条件的优化研究
• 3.3.1 不同碳源对生长与产酶的影响
• 3.3.2 不同氮源对生长与产酶的影响
• 3.3.3 复合碳氮源对生长与产酶的影响
• 3.3.4 不同培养时间对菌株产酶的影响
• 3.3.5 培养基初始pH值对菌株产酶的影响
• 3.3.6 不同培养基装液量对菌株产酶的影响
• 3.3.7 不同金属离子对菌株产酶的影响
• 3.3.8 不同底物诱导对生物量和产酶的影响
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 环氧化物水解酶性质的初步研究
• 摘要
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 初酶液的提取
• 2.2 EH部分酶学性质的初步研究
• 3 结果
• 3.1 不同反应温度对酶活的影响
• 3.2 酶的温度稳定性
• 3.3 不同pH下反应对酶活的影响
• 3.4 酶的pH稳定性
• 3.5 金属离子对酶活力的影响
• 3.6 有机溶剂对酶活的影响
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四章 菌体及初酶液对DON的转化
• 摘要
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 初酶液的提取及菌体悬浮液的处理
• 2.2 菌体对DON的转化
• 2.3 初酶液对DON的转化
• 2.4 DON的检测
• 2.5 绘制标准曲线
• 3 结果
• 3.1 DON标准曲线的绘制
• 3.2 HPLC检测样品DON浓度
• 3.3 菌体优化前后对DON转化率的比较
• 3.4 初酶液对DON转化率的测定
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢