论文摘要
目的:本研究拟建立一步法实时RT-PCR检测Nipah病毒（Nipah virus,NiV）、Hendra病毒（Hendra virus,HeV）和西尼罗病毒（West nile virus,WNV）的方法,用于三种嗜神经病毒的快速、准确、敏感、特异的定量检测,为大规模流行病学监测提供一种简便易行的检测手段,并使用所建立的嗜神经病毒检测方法,对采集自中国重庆、四川、贵州和广西地区的猪外周血样本进行NiV和HeV检测,以获得我国西部地区的NiV和HeV的病毒流行病学资料,评估我国西部地区的生物安全现状。方法:1根据GenBank提供的基因序列,针对三种嗜神经病毒基因的保守区域（NiV N基因、HeV N基因和WNV E基因）,设计并合成特异性引物和荧光标记TaqMan探针。从澳大利亚动物健康实验室（AAHL）及中国军事医学科学院（AMMS）惠赠的分别含有目的基因的质粒出发,利用PCR方法扩增获得目的基因,克隆至pBS-T载体进行体外转录,将得到的RNA纯化并使用RiboGreen方法进行定量后作为阳性标准品。分别建立三种嗜神经病毒的一步法实时RT-PCR方法并分析敏感性和特异性。2自2007年6月起,采集自中国西部地区重庆、四川、贵州和广西省市饲养的猪外周血标本320份,使用密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞,应用Trizol法提取细胞总RNA。用已建立的NiV和HeV一步法实时RT-PCR检测方法,对RNA样本进行NiV和HeV检测。对阳性样本进行PCR产物序列鉴定、序列分析等研究,在可能的情况下进行病毒分离培养,并提交流行病学调查报告。结果:1对所设计的NiV和HeV引物和探针序列,登录美国国立卫生研究院网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行Blast检索,所设计的引物和探针可以与所有已公布的NiV病毒株（DQ508095,AF376747,AF212302,AY029768,AY029767,AJ627196,AJ564623,AJ564622,AJ564621,AY858110和AY988601）序列完全匹配。不与Hendra病毒株（AF017149）产生阳性结果。本研究建立NiV和HeV一步法实时RT-PCR方法的最低检出限即敏感性分别为1.7×102copies/μl和2.6×101copies/μl,标准曲线的定量范围分别为1.7×102～1.7×106copies/μl、2.6×101～2.6×107copies/μl,相关系数R2分别为0.9998和0.9896,不与其他病毒发生非特异反应。2对所设计的WNV引物和探针序列,登录美国国立卫生研究院网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行Blast检索,所设计的引物和探针可以与已公布的WNV病毒株(（EU394703、AY262283、DQ377178、DQ374650、AF404753、AF481864、EF571854、EF530047、EU155484、EF657887、DQ983578、EF431693、DQ666448等）列完全匹配,不与其他病毒匹配。本研究建立WNV一步法实时RT-PCR检测方法的最低检出限即敏感性为3.6×102copies/μl,标准曲线的定量范围为3.6x107～3.6×102copies/μl,相关系数R2为0.97534,不与其他病毒发生非特异反应。3对采集自中国西部地区（重庆、四川、贵州和广西）饲养的猪的样本进行NiV和HeV核酸检测,成功进行了一步法实时RT-PCR反应,所有样本荧光扩增曲线均无Takeoff点,曲线平坦,判为阴性结果。结论:1本研究构建了NiV N基因、HeV N基因和WNV E基因核酸定量检测用的RNA标准品,并建立了NiV、HeV和WNV三种嗜神经病毒的一步法实时RT-PCR检测方法。该方法检测快速,具有较好的灵敏性和特异性,不易出现污染引起假阳性结果,适于流行病学研究和病毒性疾病的诊断。2初步流行病学研究提示我国西部地区（重庆、四川、贵州、广西）饲养的猪中可能不存在NiV和HeV感染,上述地区出现NiV和HeV爆发的可能性较小。