猪泛素—蛋白酶体途径定位、序列及性状关联分析

论文摘要

现代育种技术使猪的生产性能得到了显著的改良，然而随着人民生活水平的提高，对猪肉品质的要求也随之提高，在改进猪肉口味的同时要求减少药物残留。畜牧生产的重点因此包括两个方面：一方面提高瘦肉的生长速度、改良肉质；另一方面提高猪的抗病性，从而降低生产成本，提高畜产品的质量，与国际接轨。本研究利用生物信息学与分子生物学技术相结合的方法，克隆和定位了泛素—蛋白酶体途径的相关新基因，并对这些基因与部分生长性状和免疫性状进行了初步关联分析，取得了如下结果：1．以人的同源基因的cDNA序列为探针，从GeneBank中搜索猪的同源EST，由EST构成的连接群设计引物，从猪的基因组中分离克隆了34个基因片段。这34个基因是（1）20S蛋白酶体基因alpha亚基基因PSMA1，PSMA2，PSMA3，PSMA5，PSMA6，PSMA7；20S蛋白酶体基因beta亚基基因PSMB1，PSMB2，PSMB3，PSMB4，PSMB5，PSMB6，PSMB7，PSMB8，PSMB9，PSMB10；（2）19S蛋白酶体基因PSMD7，PSMD8，PSMD9，PSMD10，PSMD11，PSMD12，PSMD13，PSMD14；（3）信号酶体基因SGN1，SGN2，SGN3，SGN4，SGN5，SGN6，SGN7，SGN8；（4）泛素特异活化酶基因USP6，USP10。2．采用电脑克隆策略结合RT-PCR技术，获得了PSMB4，PSMB6，PSMB8，PSMB9，PSMB10基因的完整编码区序列（coding sequence，CDS）和PSMB4，PSMB6，PSMB8，PSMB10基因的基因组全长，进行了物种同源基因序列比对分析和蛋白质序列的推导及功能域的预测。3．采用RT—PCR和Q-PCR方法检测了PSMB4，PSMB6，PSMBS，PSMB10基因在通城猪的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪7个组织中的表达差异，除了PSMB8在心脏和肌肉中不表达外，其余基因在所检测的组织中都有表达。4．用猪×仓鼠辐射杂种板将新分离的25个基因进行了染色体精细定位，结果如下：PSMA1定位在SSC2，PSMA2定位在SSC18，PSMA3定位在SSC14，PSMA5定位在SSC4，PSMA6定位在SSC17，PSMB2定位在SSC6，PSMB3定位在SSC12，PSMB4定位在SSC4，PSMB6定位在SSC12，PSMB7定位在SSC1，PSMB8定位在SSC7，PSMB9定位在SSC7，PSMB10定位在SSC6，PSMD8定位在SSC6，PSMD9定位在SSC14，PSMD10定位在SSCX，PSMD12定位在SSC12，PSMD13定位在SSC2，PSMD14定位在SSC15，SGN2定位在SSC1，SGN4定位在SSC8，SGN5定位在SSC4，SGN6定位在SSC3，USP6定位在SSC12，USP10定位在SSC6。5．运用PCR-RFLP结合DHLPC，PCR-SSCP方法，检测了PSMA1，PSMA6，PSMB4，PSMB6，PSMB8，PSMB10等6个基因10个位点的多态性，分析了不同猪种中的基因频率和基因型频率，以及各等位基因在不同猪品种中的分布差异。6．以本室与通城县畜牧局种畜场合作所建立的实验群体中的长白猪（22头）、大白猪（23头）、通城猪（58头）、长大通（27头）、大长通（26头）为材料，分析了PSMA1，PSMA6，PSMB4，PSMB6，PSMB8，PSMB10基因的DNA多态位点与部分生产性状和免疫性状的关联，结果发现：除PSMB4基因外，其余基因和部分生产性状、免疫性状均有一定的关联。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 一 文献综述
• 1.1 猪抗病育种研究现状
• 1.2 猪免疫性状相关基因研究进展及在标记辅助育种中的应用
• 1.3 泛素—蛋白酶体途径：蛋白质的重要降解途径
• 1.3.1 泛素—蛋白酶体途径的组成
• 1.3.1.1 泛素
• 1.3.1.2 蛋白酶体的组成与结构
• 1.3.1.3 泛素一蛋白酶体途径中的酶类
• 1.3.2 泛素—蛋白酶体途径的功能
• 1.3.2.1 泛素—蛋白酶体途径与MHC Ⅰ类分子呈递
• 1.3.2.2 泛素—蛋白酶体途径与内质网存留蛋白
• 1.3.2.3 泛素—蛋白酶体途径与膜蛋白
• 1.3.2.4 泛素—蛋白酶体途径与细胞周期
• 1.3.2.5 泛素—蛋白酶体途径与NF-kB
• 1.3.2.6 泛素—蛋白酶体途径与肿瘤发生
• 1.3.3 泛素—蛋白酶体途径的研究进展
• 1.3.3.1 成熟的蛋白酶体的形成
• 1.3.3.2 蛋白酶体水解功能的揭示
• 1.3.3.3 蛋白酶体基因的研究进展
• 1.3.3.4 泛素特异蛋白酶基因的研究进展
• 1.3.4 泛素—蛋白酶体途径相关基因的研究前景
• 二 本研究的目的和意义
• 三 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 样品
• 3.1.1.1 DNA样品
• 3.1.1.2 组织样品
• 3.1.2 试剂
• 3.1.2.1 主要试剂
• 3.1.2.2 其它试剂
• 3.1.2.3 菌株和培养基
• 3.1.2.4 试剂的配制
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 主要分子生物学软件
• 3.2 方法
• 3.2.1 样品的制备方法
• 3.2.1.1 样品DNA的提取
• 3.2.1.2 样品RNA的提取
• 3.2.1.3 cDNA的制备
• 3.2.2 PCR产物的纯化、克隆、鉴定和测序
• 3.2.3 猪泛素—蛋白酶体途径相关基因片段的分离方法
• 3.2.3.1 电脑克隆策略
• 3.2.3.2 候选基因法
• 3.2.3.3 引物的设计
• 3.2.3.4 PCR扩增条件
• 3.2.3.5 PCR产物的纯化、克隆,鉴定和测序
• 3.2.3.6 序列分析及新基因的鉴定
• 3.2.4 获得基因CDS的方法
• 3.2.4.1 引物的设计
• 3.2.4.2 RNA的提取
• 3.2.4.3 cDNA的制备
• 3.2.4.4 PCR扩增条件
• 3.2.4.5 PCR产物的纯化、克隆,鉴定和测序
• 3.2.4.6 序列分析
• 3.2.5 获得基因组DNA全长的方法
• 3.2.5.1 引物设计
• 3.2.5.2 PCR扩增条件
• 3.2.5.3 PCR产物的回收纯化和克隆测序
• 3.2.5.4 序列分析拼接及同源性检索
• 3.2.6 基因物理定位的方法
• 3.2.6.1 引物的设计
• 3.2.6.2 PCR分型条件
• 3.2.6.3 数据分析方法
• 3.2.7 基因组织表达谱的研究方法
• 3.2.7.1 引物的设计
• 3.2.7.2 组织样的采集及总RNA的提取
• 3.2.7.3 cDNA的置备
• 3.2.7.4 RT-PCR反应体系
• 3.2.7.5 Q-PCR
• 3.2.8 基因多态性的检测方法
• 3.2.8.1 PCR-RFLP
• 3.2.8.2 PCR-DHPLC
• 3.2.9 基因型与性状关联的分析方法
• 四 结果
• 4.1 猪泛素—蛋白酶体途径新基因的片段的分离鉴定
• 4.1.1 所设计的引物
• 4.1.2 猪特异性引物扩增结果
• 4.1.3 扩增产物的序列分析结果
• 4.1.4 扩增产物的鉴定结果
• 4.2 猪泛素—蛋白酶体途径新基因的物理定位
• 4.2.1 所设计的引物
• 4.2.2 部分PCR扩增图片
• 4.2.3 PCR分型结果
• 4.2.4 RH定位结果
• 4.3 猪泛素—蛋白酶体途径新基因CDS全长和基因组全长的分离
• 4.3.1 总RNA的提取
• 4.3.2 PSMB4基因CDS全长和基因组全长的分离
• 4.3.3 PSMB6基因CDS全长和基因组全长的分离
• 4.3.4 PSMB8基因CDS全长和基因组全长的分离
• 4.3.5 PSMB9基因CDS全长和部分基因组片段的分离
• 4.3.6 PSMB10基因CDS全长和基因组全长的分离
• 4.4 猪蛋白酶体新基因的多态性检测
• 4.4.1 PSMA1基因的多态性检测
• 4.4.2 PSMA6基因的多态性检测
• 4.4.3 PSMB4基因的多态性检测
• 4.4.4 PSMB6基因的多态性检测
• 4.4.5 PSMB8基因的多态性检
• 4.4.6 PSMB10基因的多态性检测
• 4.5 猪泛素—蛋白酶体途径新基因基因型与性状关联的分析
• 4.5.1 PSMA1基因基因型与性状关联的分析
• 4.5.2 PSMA6基因基因型与性状关联的分析
• 4.5.3 PSMB6基因基因型与性状关联的分析
• 4.5.4 PSMB8基因基因型与性状关联的分析
• 4.5.5 PSMB10基因基因型与性状关联的分析
• 4.6 猪蛋白酶体新基因的组织表达谱分析
• 4.6.1 用RT-PCR对PSMB6基因进行组织表达谱分析
• 4.6.2 用RT-PCR对PSMB8基因进行组织表达谱分析
• 4.6.3 用RT-PCR对PSMB10基因进行组织表达谱分析
• 4.6.4 用QPCR对PSMB4,PSMB6,PSMB8,PSMB10基因进行组织表达谱分析
• 五 讨论
• 5.1 关于引物设计的模板
• 5.2 关于如何设计引物
• 5.2.1 进行新基因的分离
• 5.2.2 定位
• 5.2.3 多态检测
• 5.3 关于PCR的扩增条件
• 5.4 关于PCR产物测序
• 5.5 关于克隆结果的鉴定
• 5.6 关于新基因的定位
• 5.7 关于新基因CDS全长和基因组DNA全长的获得
• 5.7.1 新基因CDS全长的获得
• 5.7.2 新基因基因组DNA全长的获得
• 5.8 关于基因SNP的发现
• 5.9 关于基因多态性的检测方法
• 5.10 关于基因型与性状关联的分析
• 六 小结
• 6.1 本研究得到了如下结果
• 6.2 本研究的创新点
• 6.3 本研究的不足之处及对进一步研究的建议
• 参考文献
• 附录1 缩略词表
• 附录2 主要性状的中英文对照和缩写
• 附录3 五个基因的cDNA序列
• 在读期间已发表论文题录
• 致谢