论文摘要
本文对利用唾液链球菌嗜热亚种生产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）进行了系统研究，主要在高活力谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）[EC4.1.1.15]菌株的筛选和鉴定、GAD的纯化和酶学特性、产酶条件的优化、细胞转化法生产GABA的条件优化、深层发酵生产GABA的条件优化以及GABA的纯化等方面进行了深入探讨，并建立了GAD产生菌快速筛选的pH指示剂法、高效液相色谱测定发酵醪中GABA的方法和GAD活力测定的Berthelot比色法，结果如下：1．通过已知种属的Streptococcus salivarius subsp．thermophilus STX2，Eccherichia coli As1.487和Micrococcus luteus cMCC28001建立了GAD产生菌快速筛选的pH指示剂法，并利用该方法成功从84株不同微生物菌株中筛选到了25株GAD产生菌，其中以菌株Y-2的GAD活性最高，当菌体（按干重计）与1％谷氨酸一钠（monosodium glutamate，MSG）溶液按1：10混合，于37℃反应12 h，转化液中GABA浓度为14.52±0.93 mmol·L-1。通过形态特征、生理生化特征和16s rDNA序列分析，将菌株Y-2鉴定为唾液链球菌嗜热亚种（Streptococcus salivarius subsp．thermophilus）。S．salivarius subsp．thermophilus Y-2粗GAD的最适反应温度和pH分别为45℃和5.0，在4～40℃和pH 4.75～5.25范围内较稳定，在0～6 h呈现一级反应。2．建立了高效液相色谱测定发酵醪中GABA的方法。采用7％（V／V）乙酸水溶液对发酵醪进行预处理，以异硫氰酸苯酯作为衍生剂，用反相C18柱为分离柱，柱温为27℃，阶段洗脱，在254nm下进行检测。结果发酵醪中的GABA获得了很好分离，GABA在0～1.5 mmol·L-1范围内线性相关性好，其线性方程为y=14106.5713 x-258.24926（r=0.99928）。最小检测浓度为0.5μmol·L-1（相对标准偏差≤10％）。组间样品测定相对误差为3.571％，加样平均回收率达到了99.038％。结果表明，所建方法稳定，灵敏，重现性好，可用于测定发酵醪中的GABA。3．基于Berthelot反应的原理，建立了测定GAD活力的Berthelot比色法。通过对影响Berthelot比色法主要因素—次氯酸钠溶液的使用量进行详细研究，并模拟GAD催化反应体系中底物和产物变化过程，以L-Glu和GABA的混合溶液建立工作曲线，GABA在0～10 mmol·L-1的范围内具有良好的线性，线性方程为：y=0.0893x+0.0158（R2=0.9992）；精密度分析结果表明，测定相对误差和变异系数都＜5％；平均回收率为99.64％。Berthelot比色法测定操作程序为：取酶反应液0.4 mL，加入Na2Co3(1mol·L-1)0.1 mL、pH10.0硼酸盐缓冲液(0.2 mol·L-1)0.5 mL、6％苯酚1 mL，混匀，于室温下（20℃）在5 min内加入5.2％NaClO溶液1 mL，混匀后放置4～8 min，然后沸水浴10 min，立即冰浴20 min，待溶液出现蓝绿色后，加入2.0 mL 60％乙醇溶液，混匀后于20℃水浴中放置30 min，测定640 nm处的吸收值。分别采用Berthelot比色法和高效液相色谱法对GAD活力进行测定，两种方法的测定结果相对误差为4.35％。4．首次通过（NH4）2SO4分级沉淀、等电点沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、HiPrep16／10 Phenyl FF疏水层析和Sephadex G-100凝胶层析对S．salivarius subsp。thermophilus Y-2 GAD进行了纯化，获得了电泳纯GAD，较粗酶液纯化了21.97倍，比酶活为103.92 U·mg-1，酶活力回收率为7.84％。GAD的亚基和全酶相对分子量分别为46.85 kDa和103.57 kDa，表明GAD由2个大小相等的亚基组成的二聚体。GAD等电点为pH 4.2，最适反应温度和pH分别为55℃和pH 4.0，在4～60℃和pH3.75～4.5范围内稳定。在测试的19种氨基酸中只以L-Glu为底物，而对D-Glu等18种氨基酸没有催化作用，具有很强的底物特异性和立体结构选择性，对L-Glu的Km和Vmax分别为2.348 mmol·L-1和4.627 mmol·L-1·h-1。GAD的N-末端氨基酸序列为NH2-Met-Asn-GlU-Lvs-Leu-Phe-Arg-Glu-Ile-。该序列与报道的其他蛋白质序列均不一致，结果显示该GAD为新的GAD。表面活性剂十二烷基硫酸钠、Tween 20、Tween 40、Tween 80和Triton X-100对GAD都有不同程度的抑制作用，分别抑制了91.61％，11.32％、13.28％、16.21％和15.86％的GAD活力。当终浓度为5 mmol·L-1时，BaCl2对GAD活性具有显著的促进作用，酶活力提高了22.53％，但是当终浓度为50 mmol·L-1时，却对GAD活性具有抑制作用；低浓度和高浓度的FeSO4、FeCl3、ZnSO4、MnSO4、Pb（Ac）2、AgNO3、CoCl2、和CuSO4对GAD活性都有强烈的抑制作用；5 mmol·L-1CaCl2对GAD的活性影响不大，但50 mmol·L-1CaCl2却抑制了18.74％GAD活性；5 mmol·L-1和50 mmol·L-1MgCl2对GAD均没有影响。低浓度(5 mmol·L-1)NaCl、KCl和LiCl对GAD活性有轻微的抑制作用或没有影响，但在高浓度(50 mmol·L-1)时却对GAD活性呈现促进作用，其机制主要是通过弱抑制作用、降低CO2溶解度和增加酶蛋白的溶解性共同作用而影响GAD活性。5．通过单次单因子实验法、Plackett-Burman设计法和Box-Behnken响应曲面法对S．salivarius subsp．thermophilus Y-2产GAD的适宜条件进行考察，结果表明最适产GAD的培养基组成为：蛋白胨15 g·L-1，牛肉膏12.5 g·L-1，蔗糖12.5 g·L-1，柠檬酸二铵2.0 g·L-1，乙酸钠5.0 g·L-1，K2HPO4 1.03 g·L-1，CaCl2 2.12 g·L-1，Tween 80 1.0mL·L-1，pH 6.79；最适发酵条件为：接种量2％，发酵温度37℃，发酵时间12 h。在该优化条件下，200 mL发酵醪的菌体总GAD活力达到了257.46±5.12 U，较优化前（MRS培养基，177.31±9.33 U）提高了1.45倍。6．通过对反应pH、反应温度、重金属盐、表面活性剂、底物浓度、菌体浓度和磷酸吡哆醛（pyrodoxal-5′-phosphate，PLP）等因素对S．salivarius subsp．thermophilus Y-2细胞转化法生产GABA的影响进行考察和分析，获得了反应体系的最佳组成为：湿菌体25 g·L-1、BaCl2 40 mmol·L-1、Triton X-100 0.02％（V／V）、MSG 47.5 g·L-1和L-Glu90.0 g·L-1。当该体系在40℃、pH 4.5和搅拌速度100 rpm的最适转化条件下进行反应72 h，转化液GABA浓度达到了87.16±4.33 g·L-1，细胞平均生产力为48.42±2.41mgGABA·h-1·gcells-1，摩尔转化率为97.60±4.71％。7．通过对一步法发酵中S．salivarius subsp．thermophilus Y-2的生长情况、pH变化和细胞内外GABA的变化情况进行考察，首次发现S．salivarius subsp．thermophilus合成GABA的过程与GAD的生物化学性质有密切关系。基于GAD的性质，将S．salivarius subsp．thermophilus Y-2的最适产GAD条件与GABA的合成条件进行有机分离，建立了二步法发酵生产GABA，并对MSG的添加时间、MSG添加量、PLP的添加时间和不同中和剂对二步法发酵生产GABA的影响进行了考察，结果表明，S．salivarius subsp．thermophilus合成GABA的最适培养基为：MSG 12 g·L-1，蛋白胨15g·L-1，牛肉膏12.5 g·L-1，蔗糖12.5 g·L-1，柠檬酸二铵2.0 g·L-1，乙酸钠5.0 g·L-1，K2HPO41.03 g·L-1，CaCl2 2.12 g·L-1，Tween 80 1.0 mL·L-1，pH 6.79。最适发酵条件为：接种量2％（V／V），在100 rpm搅拌和不通气的条件下于37℃发酵24 h，然后于40℃和pH4.5继续发酵48 h。在该条件下，通过75 L发酵罐进行发酵，发酵醪中GABA浓度达到了6271.79 mg·L-1，较一步法(4534.03 mg·L-1，84 h)提高了1.38倍，发酵时间缩短了12 h，摩尔转化率为85.75％。8．通过等电点沉淀和732强酸阳离子交换树脂对S．salivarius subsp．thermophilus Y-2细胞转化液中的GABA进行纯化，GABA的总回收率达到了84.13％。纯化的GABA产品质量较好，GABA的外观为白色粉末状固体，GABA含量为97.81±0.67％，灰分为0.449±0.002％，干燥失重为1.79±0.06％，铅、砷和汞分别为0.4093±0.0001、0.0511±0.0001和0.0950±0.0000 mg·kg-1，因此在食品行业中具有极好的应用前景。
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