三种重金属单抗的制备与抗体基因序列分析及其免疫检测方法的建立

论文摘要

重金属污染事件层出不穷,愈演愈烈,畜禽产品重金属残留不同程度超标,威胁人畜健康。快速、廉价地监测生境中重金属是减小其对人类及动物危害的先决条件。建立更快速、更经济的免疫分析法检测重金属是生产及经济发展的需要。本研究旨在建立能够稳定分泌高亲和力和特异性抗重金属汞、铜和锌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,克隆抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的重链和轻链可变区基因,建立其免疫分析方法并得到初步应用。本研究将重金属（汞、铜和锌）通过双功能螯合剂与血蓝蛋白偶联制备了免疫抗原,与牛血清白蛋白偶联制备了检测抗原。通过BCA法、紫外分光光度法、SDS-PAGE电泳和石墨炉原子吸收光谱法鉴定重金属汞、铜和锌螯合物人工抗原。用合成的免疫抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立能稳定分泌抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分析杂交瘤细胞的染色体,鉴定。通过抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的类和亚类,通过体内诱导法大量制备并纯化抗体,通过间接酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测抗体效价、亲和力和细胞株分泌抗体的稳定性,间接竞争ELISA（IC-ELISA）法测定抗体的特异性。通过提取杂交瘤总RNA、RT-PCR,扩增抗体可变区基因,克隆测序分析该基因。采用矩阵实验确定抗原抗体的最佳组合,通过对封闭物、pH值、离子强度等影响因子的研究,确定IC-ELISA的最佳工作参数。研究结果表明:成功制备了汞、铜和锌的免疫抗原和检测抗原,并建立了能稳定分泌特异性抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的杂交瘤细胞株分别为3G4-G5、9D11-F3和Z1A5,抗体均为IgM亚类,轻链为kappa型,亲和力达109L/mol～1010L/mol,半数抑制浓度（IC50）分别为1.15μM、0.257μg/mL和0.628μg/mL,与其他金属的交叉反应低。从杂交瘤细胞3G4-G5、9D11-F3和Z1A5中克隆得到了抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的重链和轻链可变区基因。在IC-ELISA最佳工作参数确定的情况下,建立定量测定金属离子汞、铜和锌的方法,检测范围（IC20～IC80）分别为0.15μM～9.0μM,0.055μg/mL～1.198μg/mL和0.062μg/mL～6.341μg/mL,最低检测限分别为3.94×10-5mM,0.0227μg/mL和0.015μg/mL。水样中的汞、铜和锌添加回收率为分别为88.9%～107.3%,87.4%～106.8%和88.6%～109.4%。本研究成功制备了重金属汞、铜和锌抗原,建立了3株能稳定分泌高亲和力、高特异性抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的杂交瘤细胞,且克隆得到了抗重金属汞、铜和锌单克隆抗体的重链和轻链可变区基因,为下一步通过基因工程改造抗体奠定了基础。建立重金属汞、铜和锌残留IC-ELISA检测法,并能有效地用于实验室水样的重金属汞、铜和锌残留检测,为重金属汞、铜和锌残留检测试剂盒的研发奠定了基础,为农畜产品及环境安全检测提供了重要的工具,对提高风险评估工作的效率和质量,保障食品安全有重要现实意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 重金属污染状况研究进展
• 1.1.1 重金属对水的污染
• 1.1.2 重金属对大气的污染
• 1.1.3 重金属对土壤的污染
• 1.2 重金属汞的污染及危害
• 1.2.1 重金属汞污染
• 1.2.2 重金属汞危害
• 1.3 重金属铜的污染及危害
• 1.3.1 重金属铜污染
• 1.3.2 金属铜危害
• 1.4 重金属锌的污染及危害
• 1.4.1 重金属锌污染
• 1.4.2 重金属锌危害
• 1.5 重金属污染的防治措施
• 1.6 重金属检测技术
• 1.6.1 重金属的常规性检测方法
• 1.6.2 重金属的免疫检测方法
• 1.7 重金属抗原和抗体制备技术研究进展
• 1.7.1 重金属人工抗原的合成
• 1.7.2 重金属抗体的制备
• 1.8 研究的目的和意义
• 2 重金属汞、铜和锌螯合抗原的制备与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 重金属汞人工螯合抗原的鉴定
• 2.2.2 重金属铜螯合抗原的鉴定
• 2.2.3 重金属锌螯合抗原的鉴定
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 3 重金属汞、铜和锌单克隆抗体的制备及鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 汞单克隆抗体的制备与鉴定
• 3.2.2 铜单克隆抗体的制备与鉴定
• 3.2.3 锌单克隆抗体的制备与鉴定
• 3.3 讨论
• 3.3.1 小鼠免疫与融合小鼠的筛选
• 3.3.2 细胞的融合
• 3.3.3 杂交瘤细胞阳性克隆的筛选
• 3.3.4 大量制备单克隆抗体
• 3.3.5 抗体的免疫学特性
• 3.4 结论
• 4 重金属汞、铜和锌螯合物抗体基因克隆及序列剖析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 cDNA 的质量
• 4.2.2 VH和VL PCR 扩增
• 4.2.3 菌落PCR 鉴定
• 4.2.4 双酶切鉴定
• 4.2.5 VH和VL鉴定分析
• 4.2.6 VH和VL序列剖析
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 5 重金属汞、铜和锌离子免疫检测方法的建立
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 重金属汞单克隆抗体免疫检测方法的建立
• 5.2.2 重金属铜单克隆抗体免疫检测方法的建立
• 5.2.3 重金属锌单克隆抗体免疫检测方法的建立
• 5.3 讨论
• 5.4 结论
• 6 结论
• 7 创新点
• 致谢
• 附录
• 参考文献
• 作者简介