农杆菌介导铁载体基因IRT1转化八棱海棠的研究

论文摘要

本实验在实验室原有八棱海棠再生体系的基础上,采用了农杆菌介导法将IRT1基因转入八棱海棠中,获得了4个携带IRT1基因的八棱海棠株系。同时,本实验还初步探讨了不同继代次数对八棱海棠离体培养和遗传转化的影响。研究结果如下:1.以离体培养不同继代次数的八棱海棠的芽苗和幼叶为材料,来研究其对离体培养和遗传转化的影响。研究表明:随继代培养次数的增加,继代10次和48次的八棱海棠离体增殖倍数、生根能力、不定芽的再生频率、每外植体再生芽数和GUS基因瞬时表达率均显著高于继代5次的;继代10次的增殖倍数和GUS阳性率明显多于继代48次的,其它指标相互间差异不显著;说明继代10次的芽苗较适合用于八棱海棠离体培养的外殖体材料,其幼叶较适于遗传转化研究。2.本研究在本实验室苹果遗传转化体系的基础上,通过研究两种农杆菌菌株LBA4404和GV3101、km对八棱海棠继代苗的影响、km选择压的确定、Km加入时间、用加入头孢的MS0清洗的时间及AS加入的方式对八棱海棠遗传转化的影响,建立了八棱海棠简单、高效的遗传转化体系:以LBA4404为侵染菌,加入75μmol/LAS的MS0活化菌株,剪取在继代培养基上培养35d的继代苗的芽苗,再转接在新的继代培养基上培养10d的叶片为实验材料,在加入AS的再生培养基上共培养3d,用加入头孢的MS0清洗共培养后的叶片10min,然后转入延后培养基（MS+BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+cb 250mg/L）上培养3d,再转到筛选培养基（MS+BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+km25 mg/L+cb 250mg/L）上,当再生苗高2cm时,将苗转入选择培养（MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+Km50mg/L）进行选择培养的遗传转化体系。3.实验分别用两种菌株同时侵染八棱海棠的叶片,两种菌株AT126和AT96分别获得了具有Km抗性的17个和7个株系,转化率分别为6.58%和1.86%。通过生根检测、GUS基因检测、PCR扩增以及RT-PCR检测等方法表明,IRT1基因已经整合到其中4个八棱海棠转化植株的基因组中。缺铁性检测表明,4个株系中有1个株系的叶绿素含量和黄化指数与非转基因株系无显著差异,另外3个株系缺铁的抗性比对照有不同程度的提高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 植物铁吸收研究进展
• 1.1 植物的铁营养
• 1.2 植物在缺铁胁迫下利用铁的机理
• 1.3 铁载体IRT1基因及相关基因研究进展
• 1.3.1 IRT1基因的结构
• 1.3.2 IRT1基因的功能
• 2 苹果的叶片不定芽再生及遗传转化研究进展
• 2.1 苹果叶片不定芽再生
• 2.2 苹果遗传转化研究进展
• 2.3 影响农杆菌遗传转化率的因素
• 2.4 苹果转基因技术存在的问题及展望
• 第二章 不同继代培养次数对八棱海棠离体培养和遗传转化的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 培养方法
• 1.4 调查与统计
• 2 结果与分析
• 2.1 不同继代培养次数对八棱海棠离体繁殖的影响
• 2.2 不同继代培养次数对八棱海棠离体叶片不定芽再生的影响
• 2.3 不同继代培养次数离体新梢上叶片遗传转化的转化率
• 3 讨论
• 第三章 农杆菌介导八棱海棠遗传转化体系的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 八棱海棠继代时卡那霉素的确定
• 2.2 再生卡那霉素选择压的确定
• 2.3 农杆菌菌株类型对八棱海棠遗传转化效率的影响
• 2.4 Km加入时间对遗传转化效率的影响
• 0清洗时间对GUS瞬时表达率的影响'>2.5 加入头孢霉素的MS₀清洗时间对GUS瞬时表达率的影响
• 2.6 AS加入的方式对遗传转化效率的影响
• 2.7 不同培养方式的继代苗对八棱海棠遗传转化的影响
• 3 讨论
• 第四章 转IRT1基因八棱海棠植株的获得与检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因株系的获得
• 2.2 转基因八棱海棠植株的GUS组织化学染色检测
• 2.3 八棱海棠抗性植株的生根检测
• 2.4 转基因八棱海棠植株的PCR检测
• 2.5 转基因八棱海棠植株的RT-PCR检测
• 2.6 缺铁性检测
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 硕士在读期间发表的论文
• 致谢