论文摘要
研究背景血管内膜损伤后内皮修复主要依靠损伤血管内膜边缘的内皮细胞及循环中的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）。损伤局部边缘内皮增生、迁移形成的再生内皮常存在表型改变和/或功能紊乱,不能发挥正常内皮功能;而EPCs在微环境中能成为适宜局部生长的内皮细胞,并行使内皮细胞功能。因此,EPCs移植成为治疗血管损伤最有前景的方法之一。但由于缺乏特异性引导信号,EPCs在损伤处富集率低下往往导致移植效率不高。如能找到引导EPCs特异富集至受损血管内膜的相关分子,则可大大提高细胞移植效率。众所周知,血管损伤后血小板可特异黏附至损伤血管壁。如通过某种技术将血小板的特异黏附能力赋予EPCs,则可能解决此问题。介导血小板黏附至损伤血管壁最重要的分子是血管性假血友病因子（vWF）。vWF的A3区（vWF A3）是与内皮下胶原特异结合的关键部位。血管受损时,A3首先与暴露的内皮下胶原结合,再通过A1黏附血小板,从而介导血小板特异黏附受损血管壁。如果使移植EPCs携带vWF A3,则有可能使EPCs具有类似于血小板特异性黏附受损血管壁的能力。基因转染可使EPCs表达vWF A3,但如何才能控制其表达于细胞表面,而非细胞内呢?新兴的蛋白质转染技术为该问题的解决提供了策略。该技术利用基因工程手段将糖基化磷脂酰肌醇（glycosyl- phosphatidylinositol,GPI）与目的蛋白质融合表达,获得的目的蛋白能够通过其GPI结构锚定于细胞膜表面,而不跨越磷脂膜双层结构。应用此技术可能获得表面携带vWF A3的EPCs细胞,促进EPCs向血管内膜损伤局部富集。研究目的获得具有能与损伤血管壁内膜下胶原特异结合的新型引导分子的EPCs,检测其是否具有向损伤血管局部富集及促损伤血管修复的效应,为探索血管内膜损伤修复提供新思路。研究方法1.构建含GPI结构的vWF A3融合蛋白真核表达质粒通过RT-PCR方法分别获得血管性假血友病因子A3区（vWF A3）及GPI信号肽编码序列,通过PCR方法将FLAG标签加入GPI编码序列上游;通过酶切连接,将vWF A3编码基因和GPI编码基因同时插入到真核表达质粒pcDNA3.1（-）中。2.重组蛋白vWF A3-GPI的表达与纯化应用脂质体将pcDNA3.1（-）-vWF A3-GPI转染至CHO细胞, G418筛选。以荧光抗体流式细胞术（FCM）挑取阳性克隆。细胞爬片,免疫荧光激光共聚焦显微镜观察。磷脂酰肌醇磷脂酶C（PI-PLC）处理,FCM检测处理前后细胞表面融合蛋白变化。用免疫亲和层析方法纯化表达蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。3.重组蛋白vWF A3-GPI的生物活性分析采用ELISA分析重组蛋白vWF A3-GPI与胶原的结合活性,采用FCM分析vWF A3-GPI对EPCs细胞膜的锚定作用,采用CCK8法分析vWF A3-GPI修饰后EPCs增殖活性的变化及其胶原结合能力。4.定量分析移植EPCs/vWF A3在颈动脉损伤模型动物体内的分布联合使用3H-TdR标记或GFP标记方法检测移植EPCs在颈动脉损伤模型动物体内的分布,了解vWF A3锚定修饰EPCs是否可以促进移植EPCs向血管损伤部位优势分布。5.促血管修复效应检测Evans Blue染色观察损伤动脉再内皮化情况,HE染色测定新生内膜厚度、新生内膜面积、原始管腔和狭窄管腔面积、狭窄百分面积等。研究结果1.琼脂糖凝胶电泳发现,应用设计的引物,人脐静脉内皮细胞或人脐血单个核细胞总RNA的RT-PCR产物分别有670 bp或150 bp的荧光条带。2.重组质粒pcDNA3.1（-）-vWF A3-GPI酶切分析提示插入片段约820 bp;测序结果进行Blast比对,结果显示序列完全正确,且引入了FLAG标签,可用于下一步的表达、纯化实验。3.重组质粒转染CHO细胞,G418筛选到一株高表达克隆（阳性率99.95%,荧光强度为189.41）,PI-PLC处理后其阳性率降为5.7%,荧光强度为31.99;Western blot结果显示该融合蛋白分子量为60 KD;免疫荧光激光共聚焦显微镜显示该融合蛋白主要定位在细胞膜;SDS-PAGE凝胶电泳显示,抗FLAG抗体亲和层析柱层析产物中,有一条分子量约60 KD的单一条带,Western blot显示为带FLAG标签的融合蛋白。4.根据ELISA测定选择重组蛋白最佳孵育时间为2h,最佳孵育浓度为400ng/ml,锚定EPCs后12 h,其阳性率仍为89%以上,锚定后能被PI-PLC水解,可按比例结合胶原。5.EPCs被锚定后,增殖活性无明显变化;输入颈动脉损伤模型体内,再内皮化率由对照组的20.3±2.1%增至85.7±5.1%,分布至损伤血管细胞鼠与正常血管的比值则由对照组的3.63±0.10增至28.57±0.89,具有显著性差异;荧光显微镜观察到损伤血管内膜处有表达绿色荧光蛋白的细胞,新生内膜增生程度由对照组的75±19.3%降为21±3.6%。研究结论1.通过RT-PCR技术,可从人脐静脉内皮细胞提取RNA中成功克隆出人vWF A3基因,从人脐血单个核细胞提取RNA中成功克隆出GPI锚定信号肽基因;通过基因重组技术能构建vWF A3与GPI融合基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-vWF A3-GPI,并引入FLAG标签。2.构建的融合基因表达载体转染CHO细胞后能得到有效表达,分子量约为60 KD;融合蛋白主要以细胞膜锚定形式表达;表达有融合蛋白vWF A3-GPI的CHO细胞具有胶原结合活性;通过抗FLAG亲和层析,可以获得纯化的融合蛋白vWF A3-GPI。3.用蛋白质转染法,可以使EPCs细胞膜表面携带vWF A3-GPI,并具有相当的稳定性;同时保持其胶原结合能力。4.移植EPCs能归巢于血管损伤部位,分化为内皮细胞,抑制新生内膜增生;vWF A3-GPI锚定修饰能提高EPCs向损伤血管壁富集比例,增强移植EPCs防治血管狭窄效应。5.本研究借用血小板能特异黏附受损血管壁的特点,提出了用蛋白转染法制备引导EPCs特异结合损伤血管壁的引导分子的新设想,并为这一新设想的可行性和有效性提供了实验依据;该分子还可拓展于其它需要富集至损伤血管壁,参与损伤血管修复的细胞。