论文摘要
第一部分大鼠脊髓损伤模型的建立及伤后肢体运动功能和组织病理学的评估目的:建立大鼠脊髓损伤模型。脊髓损伤后,对大鼠肢体运动功能和组织病理学进行评估。方法:1.成年、雄性TNF-α转基因大鼠（TNF-αtg大鼠）和其同窝出生的普通SD大鼠（7～8周龄,体重300±20克）,腹腔注射氯胺酮（90mg/kg）+甲苯噻嗪（10mg/kg）进行术前麻醉。对大鼠行第10胸椎单椎板切除术,利用电脑程控气动撞击脊髓致伤仪建立大鼠脊髓损伤模型:在计算机控制下,前端圆顿、铜质打击杆以150千达因的力度打击第10胸椎段脊髓,硬脊膜完好无损。2.脊髓损伤后第1、3、7、14、21、28、35、42、49和56天,应用21分的BBB后肢运动评分准则对每只大鼠的肢体运动功能进行评估。3.脊髓损伤后第6、24和72小时,每个时间点,TNF-αtg大鼠和SD大鼠各取5只,腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）麻醉后处死。将包含损伤区域的长约1cm脊髓标本,以20μm的厚度矢状轴切取冰冻组织切片。从损伤中心位置挑取冰冻组织切片应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dutp缺口末端标记技术（TUNEL）检测受伤脊髓组织内细胞凋亡。4.脊髓损伤后第7、14和56天,每个时间点,TNF-αtg大鼠和SD大鼠各取10只,麻醉后处死。损伤脊髓组织冰冻切片的制备和挑选同上。应用染色剂坚牢蓝和坚牢红进行组织病理染色,数码采集组织病理照片,图像分析软件Image J 1.37v测算病理切片的组织缺损面积。结果:1.脊髓损伤急性期（≤3天）,TNF-αtg大鼠的肢体运动功能缺陷较SD大鼠明显严重（p＜0.01）。然而,伤后第7天,TNF-αtg大鼠的肢体运动功能较SD大鼠有明显的好转（p＜0.01）,且随时间发展不断恢复改善。伤后第56天,部分TNF-αtg大鼠的肢体运动功能恢复正常（BBB评分为21分）,其余TNF-αtg大鼠也得到了明显的改善。相比,伤后第56天,虽然SD大鼠的肢体运动功能也得到了一定的恢复,但仍存在明显的缺陷（p＜0.01）。2.脊髓损伤后6小时,TNF-αtg大鼠和SD大鼠损伤组织区域开始出现细胞凋亡,24小时凋亡水平均达到峰值,伤后72小时,两组大鼠损伤组织中的细胞凋亡开始下降。此外,整个过程,TNF-αtg大鼠损伤脊髓组织中的细胞凋亡水平明显高于SD大鼠（p＜0.01）。3.脊髓损伤慢性期,TNF-αtg大鼠的组织缺损面积随时间发展逐渐减小（p＜0.01）,而SD大鼠的组织缺损面积却没有明显改变。此外,在各检测时间点,SD大鼠的组织缺损面积均明显大于TNF-αtg大鼠（第7天,p＜0.05;第14和第56天,p＜0.01）。第二部分损伤后脊髓组织内TNF-αmRNA和蛋白的表达目的:检测损伤脊髓组织内TNF-αmRNA和蛋白的表达情况。方法:1.建立大鼠脊髓损伤模型（方法同前）。2.脊髓损伤后第1、4、8、24、72小时和第7、14天,每个时间点,受伤TNF-αtg大鼠和SD大鼠各取5只,麻醉后处死。取包含损伤中心长约1cm的脊髓组织,利用实时定量聚合酶链反应技术（real-time PCR）测定受伤脊髓组织内TNF-αmRNA的表达。3.脊髓损伤后第1、4、8、24、72小时和第7、14天,每个时间点,受伤TNF-αtg大鼠和SD大鼠各取5只,麻醉后处死。取包含损伤中心长约1cm的脊髓组织,分别放入500μl组织蛋白提取液中机械匀浆,离心后提取组织蛋白上清液,利用大鼠TNF-α酶联免疫吸附试剂盒测定组织蛋白上清液中TNF-α的浓度。结果:1.脊髓损伤后,TNF-αtg大鼠和SD大鼠受伤脊髓组织中TNF-αmRNA的表达迅速增高,伤后1小时达到峰值,而后随时间发展逐渐降低,伤后72小时,两组大鼠受伤脊髓组织中TNF-αmRNA的表达量均恢复到各自伤前水平。此外,在各检测时间点,TNF-αtg大鼠受伤脊髓组织中TNF-αmRNA的表达水平均明显高于SD大鼠（p＜0.01）。2.脊髓损伤后,TNF-αtg大鼠和SD大鼠受伤脊髓组织中TNF-α的浓度迅速增高,伤后1小时达到峰值,而后随时间发展逐渐降低。伤后第7天,两组大鼠受伤脊髓组织中TNF-α的浓度均恢复到各自伤前水平（TNF-αtg大鼠维持TNF-α低浓度基本水平的表达,SD大鼠的TNF-α水平用ELISA试剂盒不能测得）。此外,整个过程TNF-αtg大鼠受伤脊髓组织中TNF-α的浓度始终明显高于SD大鼠（p＜0.01）。第三部分损伤后脊髓组织内神经细胞的改变及BDNF的表达目的:检测损伤脊髓组织内神经细胞的改变及BDNF的表达情况。方法:1.建立大鼠脊髓损伤模型（方法同前）。2.脊髓损伤后第7、14和56天,每个时间点,受伤TNF-αtg大鼠和SD大鼠各取5只,麻醉后处死。损伤脊髓组织冰冻切片的制备和挑选同前。应用小鼠抗NeuN、小鼠抗GFAP和兔抗Iba1抗体,分别对损伤脊髓组织内神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞进行免疫组化检测。3.脊髓损伤后第1、7、14和56天,每个时间点,受伤TNF-αtg大鼠和SD大鼠各取5只,麻醉后处死。组织标本的取材和组织总蛋白的提取,方法同损伤脊髓组织内TNF-α蛋白的检测。利用BDNF Emax?免疫分析试剂盒检测组织蛋白提取液中BDNF的浓度。结果:1.脊髓损伤后,SD大鼠损伤组织边缘的神经元数目随时间变化显著减少;与之相比,TNF-αtg大鼠中的神经元数目虽有减少,但下降不明显,伤后第56天,仍有较多神经元分布在组织损伤边缘,两组大鼠之间有显著差别（p＜0.01）。2.脊髓损伤后,TNF-αtg大鼠和SD大鼠受伤脊髓组织中Iba1和GFAP的表达显著增高。Iba1和GFAP分别于伤后第7天和第14天达到峰值,而后随时间发展逐渐降低。伤后第56天,SD大鼠损伤脊髓组织中Iba1和GFAP的表达几乎下降到伤前水平;而TNF-αtg大鼠仍维持较高水平。此外,在损伤慢性期,TNF-αtg大鼠受伤脊髓组织中Iba1和GFAP的表达水平始终高于SD大鼠（p＜0.05）。3.脊髓损伤后第7天,TNF-αtg大鼠和SD大鼠受伤脊髓组织内BDNF的含量显著增加（p＜0.01）,伤后第14天达到峰值,而后随时间变化逐渐降低。伤后第56天,SD大鼠受伤脊髓组织内BDNF的含量下降到其伤前水平,而TNF-αtg大鼠仍维持一较高浓度。此外,在各检测时间点,TNF-αtg大鼠损伤脊髓组织内BDNF的含量均明显高于SD大鼠（p＜0.05）。第四部分损伤后脊髓组织内TNFR1和TNFR2的表达目的:检测损伤脊髓组织内TNFR1和TNFR2的表达情况。方法:1.建立大鼠脊髓损伤模型（方法同前）。2.脊髓损伤后6小时和第7、14、56天,每个时间点,受伤TNF-αtg大鼠和SD大鼠各取5只,麻醉后处死。损伤脊髓组织冰冻切片的制备和挑选同细胞凋亡的检测。应用兔抗TNFR1和山羊抗TNFR2抗体,分别对损伤脊髓组织内TNFR1和TNFR2的表达进行免疫组化检测。结果:1.脊髓损伤后,SD大鼠和TNF-αtg大鼠受伤脊髓组织内TNFR1和TNFR2的数量及免疫反应性明显增高（p＜0.05）,伤后第7天达到峰值。而后,两组大鼠损伤脊髓组织内TNFR1的数量及免疫反应性随时间发展逐渐降低,伤后第56天几乎恢复到伤前水平。与TNFR1相比,虽然受伤7天后,两组大鼠损伤脊髓组织内TNFR2的数量及免疫反应性随时间发展也逐渐降低,但其下降的幅度远远小于TNFR1;因此,伤后第56天,两组大鼠损伤脊髓组织内TNFR2的数量及免疫反应性仍保持较高水平,与伤后第7天相比无明显差异（p＞0.05）。结论1.脊髓损伤可以诱导损伤组织内TNF-αmRNA和蛋白的表达。2.脊髓损伤急性期,TNF-α可以诱导损伤组织内细胞凋亡;损伤慢性期,TNF-α可以激活、招募星形胶质细胞和小胶质细胞而发挥神经保护作用。3.脊髓损伤可以促进损伤组织内TNFR1和TNFR2的表达,并且在损伤慢性期,TNFR1和TNFR2的表达方式有显著差异。4.TNF-α在脊髓损伤的病理生理中发挥了双重作用,即在损伤的急性期（≤3天）表现为神经破坏作用,在损伤的慢性期（≥7天）表现为神经保护作用;其机制可能与损伤脊髓组织内TNFR1和TNFR2的表达及TNF-α的浓度有关。研究意义本研究首次应用TNF-α转基因大鼠,证明了TNF-α在脊髓损伤的病理生理中发挥了双重作用,即损伤急性期的神经破坏作用和损伤慢性期的神经保护作用。TNF-α在脊髓损伤后的特定作用,可能依赖于其产生、释放的时间和其作用的细胞群。脊髓损伤早期,通过各种途径抑制TNF-α可以显著降低损伤组织内细胞凋亡的水平;损伤慢性期给予低浓度的TNF-α可以激活、招募星形胶质细胞和小胶质细胞而发挥神经保护作用。进一步研究TNF-α在脊髓损伤中发挥双重作用的机制,可能发现治疗脊髓损伤更为合理的临床治疗方案,以促进脊髓损伤患者神经功能的恢复和提高他们日常生活的质量水平。
论文目录
相关论文文献
标签：脊髓损伤论文; 肿瘤坏死因子论文; 细胞凋亡论文; 神经细胞论文; 肿瘤坏死因子受体论文;