论文摘要
钙离子作为细胞内的信息传递物质,起着调节许多重要细胞功能的作用。作为第二信使,钙离子参与生物信号的跨膜传递,介导细胞对外界刺激的应答等等。因而,准确测定活细胞内游离钙离子的浓度和其动态变化已成为化学、生命科学和基础及临床医学研究中的一个非常重要的研究领域,也是有机合成化学重要的前沿热点。荧光探针是一种极好的生物分子传感器,具备高灵敏性、快速反应时间以及通过显微镜成像能提供高空间解析度等特点。荧光探针在胞内游离钙离子测定中的应用,为细胞内钙离子的研究提供了一条简便、高效的途径。荧光素具有高的消光系数,激发和发射波长都在可见光区,在水中具有较高的荧光量子产率,无毒,成本低等优点。近年来,大量以荧光素为核心的荧光探针被开发出来。随着生物技术的不断发展,基于荧光素的荧光探针已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要作用。Ca2+荧光探针法是近年来发展起来的一种钙离子浓度的测定方法,以荧光素类细胞Ca2+荧光探针的应用最为广泛。目前已有的荧光素类细胞Ca2+荧光探针均系可见光激发的荧光探针,且大多数荧光探针属于高亲和力（低Kd值）的Ca2+荧光探针,它对细胞内Ca2+具有缓冲作用,而且高亲和力的Ca2+荧光指示剂在低[Ca2+]时容易饱和,易导致细胞内[Ca2+]分析的误差。为了改善细胞Ca2+荧光探针的生物亲和性,荧光强度和与钙离子结合力等方面的性能,本文围绕新型荧光素类细胞Ca2+荧光探针的设计、合成及在细胞信号转导中的应用展开,主要内容有以下几个方面。1.对目前广泛应用的荧光素类细胞Ca2+荧光探针的合成方法进行了改进,对合成条件进行了优化,成功合成了Fluo-3、Fluo-4和Fluo-2,并实现了Fluo-3的商品化生产。并对这三种化合物进行了结构表征。2.设计了五种未见文献报道的新型荧光素类细胞Ca2+荧光探针,对相关的三种新型细胞Ca2+荧光探针中间体进行了合成,为开发新型细胞Ca2+荧光探针提供了新思路。3.合成了五个新型荧光素类细胞Ca2+荧光探针,对这五种化合物进行了结构表征。首次报道了这五个新型荧光素类细胞Ca2+荧光探针的荧光光谱和与钙离子结合前后荧光光谱的变化。4.对其中两种新型荧光素类细胞Ca2+荧光探针的Kd值进行了测定,结果表明,这两种新型荧光素类细胞Ca2+荧光探针是一类低亲和力（高Kd值）的Ca2+荧光探针,它避免了高亲和力的Ca2+荧光指示剂容易造成指示剂过载,超出其相应范围,从而造成测量误差,不能真实反映细胞内的Ca2+浓度的缺点,可用于分析细胞器内[Ca2+]的变化和有较高浓度钙离子的细胞中钙离子的测定。5.将设计合成的新型含氟荧光素类细胞钙离子荧光探针Fluo-2FFM负载入中国仓鼠卵巢细胞中,应用OlympusⅨ71型倒置研究级荧光显微镜进行活细胞中胞内自由钙离子的检测和成像。经过测定,新合成的一系列荧光素类细胞钙离子荧光探针对细胞的毒害性小,具有优良的荧光性能和生物亲和性,可应用于活体细胞的连续测定,是一类性能优良的细胞钙离子荧光探针。