APP菌毛亚单位apfA基因克隆、原核表达及免疫原性研究

论文摘要

根据GenBank报道的猪传染性胸膜肺炎血清1型的APP apfA基因序列（NCBI登陆号:AY235718）设计并合成引物,以细菌DNA提取试剂盒提取SC-A株的总DNA为模版,用PCR方法扩增出长度为497bp的目的基因片段。将该基因克隆pMD18-T载体上,经序列测定,结果表明获得了猪传染性胸膜肺炎血清1型的SC-A株的克隆。该基因包含猪传染性胸膜肺炎血清1型的SC-A株apfA基因的全长为447个碱基的开放阅读框,编码149个氨基酸组成的功能蛋白。序列分析表明:该基因与GenBank上收录的猪传染性胸膜肺炎血清3型、4型和7型在编码的氨基酸上同源性较高,均为99.3%。将猪传染性胸膜肺炎血清1型的SC-A株apfA基因的信号肽去除后,应用PCR技术扩增出编码apfA成熟蛋白的基因,并将该成熟蛋白基因重组到原核表达载体pET-32a（+）。经酶切、PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为APP的apfA基因原核表达质粒。将重组质粒转入表达菌BL21star（DE3）细胞,阳性菌落筛选、SDS-PAGE分析以及Western blot分析表明,成功构建了APP的apfA的大肠杆菌基因工程菌株。用IPTG作为诱导剂对基因工程菌株进行诱导。结果显示,在分子量约为32kDa处有明显得蛋白质表达条带,与预期的融合APP apfA成熟蛋白大小一致。表达的蛋白质主要以不溶性包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的42.5%。重组成熟蛋白纯化复性后,免疫小白鼠,经ELISA检测发现,随免疫次数的增加抗体滴度逐渐升高:经APP SC-A株5×LD50攻毒后,结果证明该蛋白对小鼠具有一定的保护力。保护率为16.6%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 病原学
• 1.1 APP微生物学特征
• 1.2 抗原与血清学研究进展
• 1.3 APP主要毒力因子及其致病性和免疫原性的研究进展
• 1.3.1 荚膜多糖
• 1.3.2 脂多糖
• 1.3.3 外毒素
• 1.3.4 外膜蛋白
• 1.3.5 转铁结合蛋白
• 1.3.6 粘附素
• 1.3.7 其它毒力因子
• 1.4 APP菌毛研究进展
• 1.4.1 APP菌毛的表达特征
• 1.4.2 APP菌毛的基因结构
• 1.4.3 主要的亚单位基因apfA
• 1.4.4 其他亚单位基因
• 1.4.5 APP菌毛的免疫原性
• 2 流行病学
• 2.1 传染源
• 2.2 传播途径
• 2.3 易感动物
• 2.4 流行特点
• 3 临床症状与病理变化
• 3.1 临床症状
• 3.2 病理变化
• 4 诊断方法
• 4.1 临床诊断
• 4.2 病原学诊断
• 4.3 血清学诊断
• 4.3.1 补体结合试验
• 4.3.2 酶联免疫吸附试验
• 4.3.3 间接血凝试验
• 4.3.4 乳胶凝集试验
• 4.3.5 其它血清学检测方法
• 4.4 分子生物学诊断
• 4.4.1 PCR技术
• 4.3.2 DNA指纹识别技术
• 4.3.3 核酸杂交技术
• 5 防治
• 5.1 饲养管理
• 5.2 免疫防制
• 5.3 药物预防与治疗
• 6 实验研究的目的和意义
• 第二章 apfA基因的克隆与序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 试剂及主要培养基
• 2.1.4 溶液配制
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 APP细菌DNA的提取
• 2.2.2 PCR扩增apfA基因
• 2.2.2.1 引物设计
• 2.2.2.2 apfA基因的PCR扩增
• 2.2.2.3 apfA基因PCR扩增产物电泳检测
• 2.2.3 APP apfA基因克隆与测序
• 2.2.4 四川分离株APP apfA基因生物信息学分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 apfA基因PCR产物
• 2.3.2 pMD18-T-apfA重组质粒的PCR及酶切鉴定
• 2.3.4 pMD18-T-apfA重组质粒的序列测定
• 2.3.5 APP SC-A株apfA基因生物信息学分析
• 2.3.5.1 四川分离株APP apfA基因生物信息学分析
• 2.3.5.2 apfA基因同源性比较及进化树分析
• 2.4 结论
• 第三章 apfA成熟蛋白的原核表达及免疫原性研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和载体
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 溶液配制
• 3.1.4 实验动物
• 3.2 方法
• 3.2.1 apfA成熟蛋白基因扩增与克隆载体的构建
• 3.2.2 apfA成熟蛋白基因重组表达质粒的构建
• 3.2.3 apfA成熟蛋白基因重组表达质粒的诱导表达
• 3.2.4 apfA成熟蛋白原核表达条件的优化
• 3.2.5 apfA重组成熟蛋白的Western-blot鉴定
• 3.2.6 apfA重组蛋白免疫原性研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 apfA成熟蛋白基因扩增及克隆、表达载体的构建
• 3.3.2 apfA重组成熟蛋白的诱导表达和可溶性检测
• 3.3.3 apfA重组成熟蛋白的表达条件的优化
• 3.3.4 apfA重组成熟蛋白Western-blot鉴定
• 3.3.5 apfA重组蛋白的纯化
• 3.3.6 APP阳性血清的收集
• 50)的确定'>3.3.7 APP 1型菌的半数致死量(LD₅₀)的确定
• 3.3.8 apfA表达蛋白的最适包被浓度和待检测血清稀释度的确定
• 3.3.9 抗体检测
• 3.3.10 攻毒结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于apfA
• 3.4.2 关于原核表达系统
• 结论
• 参考文献
• 致谢