低温胁迫下高山离子芥差异蛋白质组学研究

论文摘要

低温是一个至关重要的环境因子,能够影响植物的生长,发育以及地理分布。高山离子芥是一种典型的高山冰缘植物,主要分布于亚洲中部海拔3800米以上的大陆冰川附近。在高山离子芥的生活周期中,经常忍受从15℃到-4℃的剧烈的温度变化。形态学观察发现高山离子芥不具备外在的抗低温结构,推测其内部生理及分子机制起主要的抗低温功能。本文以高山离子芥为研究对象,分析了低温下高山离子芥叶片的蛋白质组变化,鉴定了许多低温胁迫下差异表达的蛋白,并克隆了其中一个低温下上调表达蛋白的基因,对其功能进行了初步研究。我们的研究为分析植物响应低温胁迫的分子机制提供了基础资料。具体的研究结果如下：1.建立了一套适合高山离子芥叶片总蛋白质分离的双向电泳体系,获得了高分辨率和高重复性的双向电泳图谱。在Ph3-10和Ph4-7的胶图上,分别可以检测到,1000±50和1400±50个蛋白点。2.研究发现低温下高山离子芥叶片中156个蛋白点的表达出现了显著差异（变化量超过2倍,P≤0.05）。这156个点中,72个点低温下均出现了上调表达,82个点低温下均出现了下调表达。通过MALDI-TOF MS和Q-TOF MS方法,从156个蛋白点中,鉴定了84个蛋白。3.根据蛋白质功能的不同,82个蛋白可以归类为13个功能组,主要包括：光合作用,呼吸作用,信号转导和转录因子,蛋白质合成、运输、降解相关蛋白,抗逆相关蛋白,氨基酸代谢,脂代谢,能量代谢,细胞骨架以及其他代谢相关蛋白等。除了一些已经报道过的低温相关蛋白,很多未知蛋白也被发现。这些新发现的低温诱导蛋白给我们进一步研究低温响应机制提供了基础。4.研究中发现一个新的冷诱导的DEAD-box RNA解旋酶。该蛋白在低温下表达量上调七倍。根据该蛋白的质谱信息,我们从离子芥中克隆到一个新的DEAD-box RNA解旋酶基因（CbDRH）。该基因全长为2111bp,包含一个1788bp的开放阅读框,预测编码含有595个氨基酸的蛋白质。该基因与拟南芥一个功能未知的乙烯应答的DEAD box RNA解旋酶基因直系同源,含有RNA解旋酶基因家族全部的9个保守motif。5. CbDRH在冷胁迫和冻胁迫下,转录水平上均上调,UV-B和ABA也能导致其转录水平上调,但是NaCl胁迫下,其转录水平下调。CbDRH表达无器官特异性,在植物的根茎叶中均有表达。通过亚细胞定位发现,该基因定位在细胞核中。这些结果验证了我们蛋白质组学的结果,也说明了DEAD box RNA解旋酶基因是在细胞核中起作用,参与了植物多种抗性反应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 前沿
• 1 植物响应低温的机制研究进展
• 1.1 植物在低温胁迫下的生理反应
• 1.1.1 低温对植物光合作用的影响
• 1.1.2 低温对植物呼吸作用的影响
• 1.1.3 低温对植物膜系统的影响
• 1.1.4 低温对植物内小分子调节物质的影响
• 1.1.5 低温对植物抗氧化酶系统的影响
• 1.2 植物响应低温胁迫的分子机制
• 1.2.1 ABA与植物植物低温信号转导
• 1.2.2 BR与植物低温信号转导
• 2+与植物低温信号转导'>1.2.3 Ca²⁺与植物低温信号转导
• 2 蛋白质组学研究进展
• 2.1 蛋白质组学的由来
• 2.2 蛋白质组学的技术手段
• 2.3 低温胁迫下的植物差异蛋白质组学研究进展
• 3 DEAD box RNA解旋酶研究进展
• 3.1 DEAD box RNA解旋酶家族概况
• 3.2 DEAD box RNA解旋酶与非生物胁迫
• 4 高山冰缘植物研究概况
• 5 选题目的及意义
• 第二章 高山离子芥叶片响应低温的差异蛋白质组学研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 总叶绿素含量测定
• 1.2.2 细胞膜通透性测定
• 1.2.3 蛋白质提取
• 1.2.4 2-D电泳条件
• 1.2.5 凝胶扫描及分析
• 1.2.6 取点及胶内酶切
• 1.2.7 质谱鉴定及搜库
• 1.2.8 生物信息学分析
• 2 结果分析
• 2.1 不同低温处理对高山离子芥叶片总叶绿素含量影响
• 2.2 不同低温处理对高山离子芥细胞膜透性的影响
• 2.3 低温下高山离子芥叶片的双向电泳图谱分析
• 2.4 差异蛋白点的质谱鉴定
• 3 讨论
• 3.1 低温降低植物光合能力,损害细胞膜的完整性
• 3.2 差异蛋白与低温抗性之间的关系
• 3.2.1 与光合作用相关的蛋白
• 3.2.2 与抗逆相关的蛋白
• 3.2.3 与植物呼吸代谢相关的蛋白
• 3.2.4 信号转导及转录因子相关蛋白
• 3.2.5 蛋白质合成,运输及降解相关蛋白
• 3.2.6 细胞骨架相关蛋白
• 3.2.7 脂代谢相关蛋白
• 3.2.8 其他代谢相关蛋白
• 4 小结
• 第三章 高山离子芥DEAD box RNA解旋酶基因的克隆及功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 高山离子芥DEAD box RNA解旋酶基因克隆
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 RNA提取及反转录PCR
• 1.1.3 CbDRH基因中间片段扩增
• 1.1.4 RACE法扩增CbDRH基因3’木端和5’未端
• 1.1.5 CbDRH全cds序列扩增
• 1.1.6 CbDRH基因的生物信息学分析
• 1.2 不同胁迫处理下CbDRH基因的转录水平分析
• 1.2.1 实验材料及处理
• 1.2.2 RNA提取及反转录PCR
• 1.2.3 Realtime PCR实验
• 1.3 CbDRH基因在根茎叶中的表达情况
• 1.3.1 实验材料
• 1.3.2 RNA提取及反转录PCR
• 1.3.3 半定量PCR
• 1.4 CbDRH基因的亚细胞定位
• 1.4.1 实验材料
• 1.4.2 载体构建
• 1.4.3 农杆菌转化
• 1.4.4 瞬时转染烟草
• 1.4.5 结果观察
• 2 结果分析
• 2.1 CbDRH的克隆
• 2.2 转录水平上CbDRH基因对不同胁迫处理的响应
• 2.3 根茎叶中,CbDRH基因的半定量PCR分析
• 2.4 CbDRH基因的亚细胞定位
• 3 讨论
• 3.1 CbDRH基因的特性分析及进化地位
• 3.2 CbDRH基因响应不同的胁迫处理
• 3.3 CbDRH基因的定位研究
• 4 小结
• 参考文献
• 附表1
• 附表2
• 在学期间的研究成果
• 致谢