TGFβ信号调控及配体对雌激素受体的激活研究

论文摘要

转化生长因子（TGFβ）在细胞增殖、分化和凋亡过程中扮演着重要角色。TGFβ信号是通过TGFβ结合受体后,激活Smad蛋白入核实现信号传递的。胰岛素是体内调控碳水化合物代谢的重要生长因子,胰岛素信号被证明对TGFβ通路具有拮抗作用。在本研究中,利用基于荧光细胞成像技术的高内涵药物筛选系统IN Cell Analyzer 1000,我们研究了胰岛素和TGFβ信号的交互作用。结果显示胰岛素能以依赖于PI3K/AKT通路的方式,抑制TGFβ1诱导的Smad2核转移。接下来,我们证实作为胰岛素通路的负调控因子,蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）的过表达可以有效的解除胰岛素对Smad2激活的抑制。此外,我们用一个已报道的PTP1B抑制剂（化合物-2）来处理细胞,发现化合物-2能够通过抑制PTP1B的活性,重建胰岛素对Smad2活化的抑制效果。这暗示我们,也许可以利用PTP1B对胰岛素/TGFβ信号整合的调控,将其当作PTP1B抑制剂的评价手段之一。然而,当我们以另一个非特异性PTP抑制剂原钒酸钠（SOV）处理细胞时,发现SOV能够促进TGFβ1对Smad2的激活。由于SOV是一个非选择性不可逆的PTP抑制剂,我们推测SOV很可能以非PTP1B依赖的方式,增强Smad2的激活。进一步的实验证实,SOV是通过增强细胞对TGFβ1响应的敏感度,实现对Smad2激活的上调。这种致敏机制被证明是不依赖于PI3K/AKT的,同时细胞膜穴样内陷（Caveolae）对于SOV的致敏效应是必需的。最后,我们给出一个SOV对TGFβ信号的可能致敏机制。由于SOV已被报道在心血管内皮细胞中能促进一氧化氮（NO）的合成,而最近Smad2被证实为一氧化氮合成酶的转录因子,因此我们的研究为SOV对NO合成的调控,提供了一个新的解释。由于PTP1B基因敲除小鼠在表型上健康,并显示出对膳食诱导肥胖的抵抗,因此PTP1B抑制剂被认为在肥胖和二型糖尿病的治疗中,具有光明前景。在本研究中,我们从海洋天然产物中发现一个新的PTP1B抑制剂GYW-YF-002（郭跃伟教授课题组提供）,这个化合物在分子水平的酶活抑制实验中IC50值约为42μM。进一步实验显示,这个化合物是一个非竞争性PTP1B抑制剂,其Ki值大约为35μM。接着我们以IN Cell Analyzer 1000为主要工具,研究了这个化合物在细胞水平对胰岛素信号的调控效果。结果显示,在PTP1B过表达的CHO细胞中,这个抑制剂显示出对AKT激活的上调作用;同时,这个化合物能够促进胰岛素激活的GLUT4膜转移。此外,我们还研究了这个化合物对TGFβ信号的调控作用,再次证实PTP1B抑制剂,能够通过胰岛素信号调节Smad2的激活。雌激素受体属于固醇类激素受体家族成员,在哺乳动物中存在两种主要亚型（ERαand ERβ）。与配体结合后,ER发生构象变化并入核调控下游基因转录。由于共激活因子的招募对ER开启基因转录是必需的,因此我们研究了三种雌激素和两种选择性雌激素受体调节剂（SERM）,对ERα/共激活因子相互作用的调节。酵母双杂交系统中,我们研究了三种共激活因子CBP、SRC-1、RIP140与ERα的相互作用,三种雌激素都能促进它们的结合。然而两种SERM中,只有Tamoxifen在酵母和SPR实验中都表现出纯ER拮抗剂活性。Raloxifene在酵母中表现出强烈的ER激动剂活性,促进ERα与共激活因子结合;而在SPR实验中,Raloxifene表现出拮抗剂活性。作为Raloxifene激动ER招募共激活因子的第一个证据,我们的研究暗示着Raloxifene在体内和体外可能利用不同的机制,调控ER和共激活因子的相互作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 转化生长因子与胰岛素信号通路概述
• 1 转化生长因子信号通路
• 1.1.1 转化生长因子分类
• 1.1.2 转化生长因子受体
• 1.1.3 TGFβ信号的效应分子Smad
• 2 TGFβ调控的生物学效应
• 1.2.1 TGFβ的下游基因
• 1.2.2 TGFβ调控的生物学过程
• 3 胰岛素信号通路
• 1.3.1 胰岛素受体
• 1.3.2 胰岛素受体底物
• 1.3.3 胰岛素激活的P13K/AKT 通路
• 1.3.4 胰岛素激活的葡萄糖转运
• 1.3.5 PTP18 对胰岛素信号的负调控
• 1.3.6 胰岛素耐受与人类疾病
• 4 TGFβ通路的调控及其与胰岛素信号的交互作用
• 参考文献
• 第二章 PTP18 通过胰岛素通路调控Smad2 的激活
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 2.3.1 CHO 细胞对TGFβ1 的响应
• 2.3.2 胰岛素抑制TGFβ1诱导的Smad2激活过程
• 2.3.3 P13K/AKT 通路对胰岛素介导的Smad2 活化抑制是必需的
• 2.3.4 过表达PTP18能够有效减弱胰岛素对Smad2的活化抑制
• 2.3.5 PTP18抑制剂能够重建胰岛素对Smad2的活化抑制
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 原钒酸钠对TGFβ信号通路的影响
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 3.3.1 原钒酸钠上调TGFβ1 诱导的Smad2 活化
• 3.3.2 原钒酸钠能够加速TGFβ1诱导的Smad2核转移
• 3.3.3 原钒酸钠对Smad2 激活的调控作用独立于P13K/AKT 通路
• 3.3.4 细胞膜穴样凹陷（Caveolae）参与原钒酸钠对Smad2 激活的上调效应
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四章 基于荧光成像系统IN Cell Analyzer 的化合物评价
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4.3.1 GST-PTP18 的表达纯化、酶活测定以及新抑制剂的发现
• 4.3.2 抑制剂类型的确定
• 4.3.3 新PTP18 抑制剂能够增强AKT 的活化
• 4.3.4 新PTP18 抑制剂能够促进GLUT4 的膜转移
• 4.3.5 新PTP18 抑制剂能够调节胰岛素对Smad2 的活化抑制
• 4 讨论
• 参考文献
• 第五章 雌激素受体激活方式
• 1 雌激素受体的结构和功能
• 2 雌激素受体的激活
• 5.2.1 配体依赖的雌激素受体激活
• 5.2.2 非配体依赖的雌激素受体激活
• 3 雌激素受体激活后的基因调节作用
• 4 雌激素受体激活后的非基因调节作用
• 参考文献
• 第六章 配体对ER/共激活因子相互作用的调控
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 6.3.1 酵母中ERα以配体依赖的方式招募共激活因子
• 6.3.2 SERM 对E2 激活的ERα/共激活因子相互作用的调控
• 6.3.3 Raloxifene 能够激活ERα招募共激活因子
• 6.3.4 SERM 在体外对ERα/共激活因子相互作用的拮抗
• 6.3.5 配体结合对ERα-LBD 的二聚特征没有显著影响
• 4 讨论
• 参考文献
• Selected Publications
• 致谢