论文摘要
本研究根据GenBank登录序列（AF268040）设计一对特异性引物,用PCR法扩增出PCMV SC株DPOL基因,将其克隆到T载体,测序并进行生物信息学分析。测序结果表明PCMV DPOL基因全长3024bp,为一个完整ORF,共编码1008个AA；与参考毒株核苷酸同源性为98%,具有良好保守性,作为PCR引物设计模板较合适；系统进化树表明PCMV与HHV6和HHV7关系最近；运用生物信息学软件推导出该蛋白的基本性质,并预测其高级结构。以DNA聚合酶基因为模板,设计两对引物,建立猪巨细胞病毒的套氏PCR检测方法,第一步反应产物目的条带大小为769bp,第二步产物目的条带大小为236bp。对建立的方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果表明该方法对模板的最低检测量为1.1pg,具有良好的特异性、敏感性和重复性。应用该法对猪同时感染PCMV和PRRSV相关性进行初步探究,36份PRRSV阳性病料中,PCMV检出率为63.89%。又以PCMV DPOL基因、PRV gE基因、PPV VP2基因和PCV2 ORF2阅读框为模板,设计四对特异性引物,建立同时检测这四种病毒的多重PCR方法,扩增产物条带分别为：250bp、382bp、500bp和660bp。试验通过缓冲液、引物浓度组合、Taq DNA聚合酶浓度、dNTP和Mg2+浓度组合的调节对多重PCR方法反应条件进行优化。试验以PCMV为例对两种病毒基因组DNA抽提方法进行比较后发现试剂盒的效果较好,酚氯仿法效果虽稍差,但是也能保证检测的有效进行。该多重PCR方法的敏感性为10-1pg,并具有良好的重复性。将此方法中PRV、PPV和PCV2对50份实验室送检样品的检测效果与相应的国标法或行标法（PRV:GB/T 18641-2002, PPV: SN/T 1874-2007, PCV2:GB/T 21674-2008）（?）相比：多重PCR敏感性为100%,特异性为97.5%、100%和97.4%,符合率为98%、100%和98%。应用此方法对具有繁殖障碍临床表现的123份病料进行检测,四种病毒感染普遍存在,其中PCMV和PCV2感染较为严重,阳性率分别为34.1%和32.5%；两种病毒混合感染中PCMV和PCV2混合感染较为严重,阳性率为13.8%；三种病毒混合感染中PRV、PCMV和PCV2混合感染率较高,为6.5%；只有一份样品同时检出四种病毒。
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标签：猪巨细胞病毒论文; 聚合酶论文; 生物信息学分析论文; 巢氏论文; 猪伪狂犬病病毒论文; 猪细小病毒论文; 猪圆环病毒型论文; 多重论文; 诊断论文;