导读:本文包含了重组禽腺病毒论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:禽腺病毒4型,Fiber2蛋白,重组新城疫病毒,疫苗
重组禽腺病毒论文文献综述
田开月,张玉菡,杨盼盼,郭慧芳,李宁[1]（2019）在《表达禽腺病毒4型中国流行株Fiber2蛋白重组新城疫病毒的构建与鉴定》一文中研究指出利用NDV LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,将禽腺病毒4型(FAdV-4)中国流行株的全长Fiber2基因插入到NDV基因组的P和M基因之间,构建并拯救出重组病毒rLaSota-Fiber2。利用RT-PCR和序列测定,以及Western blot对重组病毒进行了鉴定。结果显示,Fiber2基因插入位置和方向正确,Fiber2蛋白得到正确表达,表达形式为可溶的游离形式而非嵌入到NDV颗粒中。第10代重组病毒的鸡胚致病性试验和在鸡胚中的生长特性研究结果显示,重组病毒的半数鸡胚感染量(EID_(50))最高可达10~(8.5)/100μL,鸡胚平均致死时间(MDT)为120 h, 1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)均为0,重组病毒保持了LaSota弱毒疫苗亲本毒株的低致病特性和对鸡胚良好的高滴度生长适应性。重组病毒与亲本LaSota株生长滴度在相近时间达到峰值,生长动力学特性与亲本株无明显差异。本试验构建的表达FAdV-4中国流行株Fiber2基因的重组病毒rLaSota-Fiber2有望为同时防控NDV和FAdV-4的感染提供安全、廉价和高效的辅助工具。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2019年09期）
柴冬华[2]（2019）在《禽腺病毒血清4型重组株的构建及生物学特性研究》一文中研究指出肝炎-心包积水综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)是由禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus 4,FAdV-4)引起的以肝炎、心包积水为特征的疾病。自2015年以来,HHS在我国大面积流行,给我国养禽业造成了严重的经济损失。然而关于FAdV-4的毒力基因则研究较少。为探讨ORF17基因对FAdV-4复制和毒力的影响,本研究以FAdV-4流行毒株HN/15102株为亲本病毒,采用同源重组技术构建ORF17基因缺失的重组病毒。首先将表达EGFP的pΔORF17-EGFP转染已感染HN/151025的鸡肝癌细胞(LMH),构建重组病毒rHN-ΔORF17-EGFP。再将EGFP表达盒去除,经蚀斑反向筛选获得rHN-ΔORF17。将rHN-ΔORF17在LMH细胞上连续传代20代,每5代进行PCR检测,结果表明rHN-ΔORF17遗传稳定。生长动力学曲线测定结果表明2株重组病毒与亲本病毒的生长动力学趋势基本一致,均在接种后96 h病毒滴度达到高峰。rHN-ΔORF17与亲本病毒HN/151025病毒滴度相近,分别为2.22×10~8 PFU/mL和4.26×10~8 PFU/mL,表明ORF17基因缺失不影响病毒复制能力;而rHN-ΔORF17-EGFP滴度显着下降(1.53×10~6PFU/mL)与亲本病毒HN/151025差异显着(P<0.05)。中国分离株FAdV-4与加拿大ON1弱毒株相比,基因组3′端缺失1966-bp序列(ORF19和ORF27),为了解该自然缺失对病毒毒力的影响,本研究以基因组3′端35430-35431位点自然缺失1966-bp序列的HN/151025为亲本病毒,构建表达EGFP的重组病毒rHN-Δ35430-EGFP。然后将1966-bp序列替换EGFP表达盒,构建补足ON1株来源的1966-bp序列的重组病毒rHN-Δ35430-ON1。rHN-Δ35430-ON1在LMH细胞上连续传代20代,每5代进行PCR检测,结果表明rHN-Δ35430-ON1遗传稳定。重组病毒生长动力学曲线测定结果表明2株重组病毒与亲本病毒的复制动力学趋势基本一致,均在接种后96 h病毒滴度达到高峰。rHN-Δ35430-EGFP滴度为6.8×10~7PFU/mL,rHN-Δ35430-ON1滴度(2.66×10~8 PFU/mL)与亲本病毒HN/151025(4.26×10~8 PFU/mL)相近,说明插入1966-bp序列不影响病毒复制。对rHN-ΔORF17和rHN-Δ35430-ON1进行致病性评价。将40只28日龄SPF鸡随机分成4组,其中3组分别用rHN-ΔORF17、rHN-Δ35430-ON1和HN/151025通过滴鼻点眼途径进行攻毒,攻毒剂量为0.1 mL 8×10~5 PFU,对照组为等体积无菌PBS,攻毒后观察鸡只症状。攻毒后第3 d,rHN-ΔORF17和HN/151025组鸡只开始出现临床症状,rHN-Δ35430-ON1组鸡只于攻毒后第4 d出现临床症状,发病鸡只表现为精神沉郁、缩脖、羽毛蓬乱、喜卧嗜睡等;攻毒组发病率均为100%,发病高峰期均在攻毒后第4~6 d,攻毒后第14 d各组鸡只逐渐开始康复。攻毒组中,HN/151025组死亡率为10%,rHN-ΔORF17组死亡率为20%,rHN-Δ35430-ON1组死亡率为10%,对照组为0。对死亡鸡只进行病理剖检,攻毒组均表现心包积液、肝脏黄色坏死灶、肾肿大,无明显差异。免疫组化攻毒组肝脏均检测到抗原。攻毒后第4~28 d,每4 d采集咽肛拭子和血清抗体。咽肛拭子排毒检测中,3组攻毒组鸡只均在第4~20 d检测到100%排毒,第24 d排毒下降,3组表现一致。血清抗体检测中,整体抗体水平无差异,仅在抗体阳转率存在差异。HN/151025组阳转率最高达88.9%,rHN-ΔORF17组阳转率最高为50%,rHN-Δ35430-ON1阳转率最高为33.3%。在第32 d进行第2次攻毒,3组均无明显临床症状。抗体阳转率也无明显差异。咽肛拭子排毒,第4~27d排毒率100%,第34~55 d下降后上升,在第62 d排毒率达100%,3组表现一致,无明显差异,且均排毒反复,排毒期长。上述结果表明,2株重组病毒对鸡的致病性与亲本病毒差异不显着。综上,ORF17基因缺失和插入自然缺失1966-bp序列对病毒复制和致病性均无影响。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2019-06-01）
刘如欣[3]（2019）在《表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组禽腺病毒的构建》一文中研究指出禽腺病毒血清型 4 型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)毒株CH/HNJZ/2015是2015年分离自我国河南的一株高致病性流行病毒株,属于禽腺病毒属中的C种,是一种没有囊膜包裹的双股DNA病毒,是肝炎-心包积液综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)的主要病原,但其致病机理尚不明确,许多未知基因的功能还有待进一步研究,因此有必要建立针对FAdV-4 CH/HNJZ/2015毒株的反向遗传操作体系,以帮助这些问题得到解决。此外,腺病毒具有病毒粒子相对稳定、致病力低、宿主范围广、遗传操作较容易、病毒滴度高、易于储存以及能装载较大外源基因等优点,在基础研究、疫苗研发、基因治疗等方面被广泛研究和应用,被认为是基因转移中最有潜力的载体之一。鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD),是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引发的一种高致死率的传染性疾病,鸡感染该病毒后导致免疫器官法氏囊严重受损,使机体对免疫应答产生抑制作用而死亡。鸡传染性法氏囊病自1957年被发现以来,在世界多个国家和地区流行,与鸡新城疫病、鸡马立克氏病并列为危害全球家禽健康的叁大传染病,其高死亡率给全球的养禽业造成了巨大的经济损失。在本研究中,通过ExoCET直接克隆技术构建了 FAdV-4 CH/HNJZ/2015毒株的全长基因组感染性克隆。并利用无缝定点改造技术在CH//HNJZ/2015的外源基因插入位点插入鸡传染性法氏囊病病毒的抗原基因VP2构建重组禽腺病毒。研究成果如下:1.禽腺病毒4型毒株CH/HNJZ/2015反向遗传体系的建立ExoCET直接克隆技术将核酸外切酶介导的体外同源重组和RecET介导的细胞内同源重组有效结合,可以快速、高效地对大片段DNA进行直接克隆。利用ExoCET直接克隆技术对FAdV-4高致病性毒株CH/HNJZ/2015基因组进行直接克隆,将其基因组克隆到了 p15A载体上,得到了含有完整病毒基因组的感染性克隆,并成功地进行了病毒拯救,首次建立了禽腺病毒4型CH/HNJZ/2015毒株的反向遗传体系,方便对其进行基因修饰和改造,为FAdV-4新型流行毒株的基因功能、致病机理等研究提供了有力的工具。2.插入鸡传染性法氏囊病病毒的抗原基因构建重组禽腺病毒质粒禽腺病毒可以容纳较大的基因片段,是一种良好的病毒载体,通过无缝定点改造技术,在CH/HNJZ/2015的外源基因插入位点处插入鸡传染性法氏囊病病毒的抗原基因VP2构建重组禽腺病毒质粒。3.重组禽腺病毒的拯救将构建得到的重组病毒质粒p15A-cm-HNJZ通过限制性酶酶切线性化,转染鸡肝癌细胞(LMH),培养6天后细胞出现明显病变,同时用特异性引物对重组病毒中的VP2基因进行了 PCR扩增,得到的条带与理论值大小一致,表明重组病毒拯救成功。4.重组禽腺病毒中外源基因的表达验证对重组病毒中的外源基因VP2进行了免疫印迹试验检测,得到了与阳性对照大小一致的条带,说明VP2能够在重组病毒中进行正常表达。通过间接免疫荧光试验确定了重组病毒所表达的VP2蛋白在细胞中的位置,结果显示目的蛋白主要在细胞质内。5.重组禽腺病毒的体外复制能力将FAdV-4 CH/HNJZ/2015野生毒株和重组病毒分别感染鸡肝癌细胞,在感染后的不同时刻收获病毒感染的细胞,测定所收获病毒的TCID50,绘制病毒的生长曲线,结果显示重组病毒rHNJZ-1966-IBDV-VP2和FAdV4亲本毒株CH/HNJZ/2015的增殖动态没有明显差异,表明重组病毒rHNJZ-1966-IBDV-VP2在体外复制能力良好。6.重组禽腺病毒的遗传稳定性检测为了检测重组病毒的遗传稳定性,将重组病毒连续传代40次,每10代进行对重组病毒基因组中的VP2基因进行一次PCR检测,结果显示,每一代的重组病毒中均能扩增出与VP2基因大小一致的条带,表明VP2基因能够在重组病毒rHNJZ-1966-IBDV-VP2复制的过程中稳定存在。本研究利用ExoCET直接克隆技术建立了禽腺病毒4型高致病性毒株CH/HNJZ/2015的反向遗传操作体系,为进一步探究未知病毒基因的功能、分子致病机理及其与宿主的互作机制等研究提供了强有效的平台。通过无缝定点改造技术在禽腺病毒CH/HNJZ/2015毒株的外源基因插入位点插入了鸡传染性法氏囊病病毒的抗原基因VP2,构建了重组禽腺病毒质粒,并成功地进行了病毒拯救,且拯救出的病毒能够在体外稳定地复制和遗传,为灭活的重组病毒载体疫苗研究奠定了基础。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-17）
柴冬华,邵昱昊,李慧昕,刘胜旺[4]（2019）在《表达EGFP标签的重组血清4型禽腺病毒的构建及评价》一文中研究指出我国当前流行的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)毒株与国外毒株相比存在自然缺失。为了解我国流行的FAdV-4毒株的复制能力和特点以及病毒毒力的增强机制,本研究以我国当前流行的基因组3′端自然缺失株HN/151025为亲本病毒,采用同源重组技术,在HN/151025毒株基因组35430～35431自然缺失位点插入EGFP表达盒,构建带有EGFP标签的重组病毒rHN-△35430-EGFP。获得的重组病毒在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,重组病毒在LMH细胞连续传代5代,EGFP基因随病毒的传代而稳定遗传,且EGFP蛋白稳定表达。病毒生长曲线测定结果显示,带有EGFP标签的重组病毒与亲本病毒的生长动力学趋势基本一致,均在接种后第96小时病毒滴度达到高峰,但是重组病毒滴度与亲本病毒差异显着(P<0.05)。对重组病毒感染细胞能力进行评价,结果表明,表达荧光信号的细胞比例从感染后第24小时逐渐增多,至感染后第96小时达到高峰,该结果与病毒生长曲线结果一致。本研究结果表明,FAdV-4病毒基因组3′端可作为标签基因插入位点,为进一步研究病毒复制和感染机制奠定基础。(本文来源于《中国兽医科学》期刊2019年08期）
张吉,安达,唐熠,刁有祥[5]（2018）在《应用重组酶聚合酶扩增技术检测I群禽腺病毒方法建立》一文中研究指出引言I群禽腺病毒(Fowl Adenovirus-I,FAdV-I)属于腺病毒科禽腺病毒属,具有共同的群抗原,分为12个血清型(1-8a,8b-11)。目前,已发现不同血清型可造成包括包涵体肝炎(inclusion body hepatitis,IBH),肌胃糜烂(gizzard erosion,GE)和心包积液(hydropercardium syndrone,HPS)等症状,引起了广泛关注。因此,建立快速且灵敏可靠的检测方法,已成为预防和控制FAdVs的关键。普遍应用的(本文来源于《中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学术研讨会论文集》期刊2018-11-21）
程昊[6]（2018）在《2015-2017年禽腺病毒的分离鉴定及分别表达禽腺病毒penton和fiber2蛋白重组新城疫病毒的构建》一文中研究指出心包积液综合征(HPS)是由禽腺病毒引起的高度传染性疾病,于1987年首次在巴基斯坦的安加拉地区爆发,因此又被称作“安加拉病”。禽腺病毒为无囊膜病毒,基因组为双链DNA,病毒的核衣壳由六邻体(hexon)、五邻体(penton)和纤丝蛋白(fiber)组成。penton蛋白是重要的结构蛋白,参与病毒侵入细胞和病毒粒子组装的过程。抗penton蛋白的抗体具有显着的病毒中和作用,由penton蛋白制备的亚单位疫苗能为动物提供90%的保护率。病毒fiber蛋白通过其N末端与penton蛋白结合,其头端在病毒感染过程中可以与细胞表面的受体结合,在病毒感染过程中起到了关键作用,通过真核和原核表达系统制备的fiber2亚单位疫苗对SPF鸡具有较强的免疫保护力。近年来禽腺病毒在我国鸡群的感染普遍,给养殖业造成了严重的经济损失,目前尚无商品化的疫苗。为了研制用于该病预防的活疫苗,本研究在病原流行病学研究基础上,以新城疫病毒(NDV)为载体表达了该病毒的五邻体和纤丝蛋白,并对重组病毒的免疫效力进行了测定,旨在为该病的防控提供有力工具。1.I群禽腺病毒的分离鉴定与遗传进化分析通过对培养基和培养条件的优化,建立了 LMH细胞培养禽腺病毒的方法,经LMH细胞扩增的禽腺病毒滴度可达到108.5TCID50/ml,而通过传统绒毛尿囊膜扩增的禽腺病毒滴度为106.5TCID50/ml,表明通过LMH细胞培养可以收获更高滴度的禽腺病毒,培养滴度较传统方法提高了 100倍。2015-2017年共收到送检疑似禽腺病毒感染样品27份,通过PCR鉴定后,分离得到了 18株Ⅰ群禽腺病毒,其中有16株属于血清4型,有2株属于血清1型,表明在我国心包积液综合征主要由血清4型禽腺病毒感染所引发。分别对16株血清4型禽腺病毒病毒的hexon、penton和fiber2基因序列进行同源性分析,发现16株病毒的这叁个基因与国内参考株之间的同源性均为100%,与国外分离株相比具有不同程度的遗传差异,其中与印度分离株最近。氨基酸序列比对分析发现国内hexon的195位氨基酸残基是Q,而国外毒株的对应位点是E;国内分离毒株penton的426位和486位分别是V和T,而国外毒株对应位点分别是I和S,表明我国流行的禽腺病毒具有特征性的遗传标记,通过这些特征性的氨基酸序列可以将国内外的禽腺病毒分离毒株进行有效区分。此外,挑选了不同年份的血清4型禽腺病毒3株,经肌肉接种SPF鸡后,可导致100%发病,剖检可见明显的心包积液病变,表明该疾病复制成功。2.分别表达禽腺病毒penton和fiber2蛋白的重组新城疫病毒构建及其免疫效力选取具有良好复制能力和免疫原性的基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)致弱毒株AI4作为骨架,分别将血清4型分离株JSYC2017株的penton和fiber2基因插入到AI4的P和M基因之间,构建得到重组NDV全长质粒:pNDV/rAI4-penton和pNDV/rAI4-fiber2。将全长质粒和NDV叁个辅助质粒共转染BSR细胞后成功拯救出重组NDV病毒,分别命名为:rAI4-penton 和 rAI4-fiber2。重组病毒的鸡胚最小致死剂量平均死亡时间(MDT)大于120h,呈典型的弱毒特性,且在鸡胚中具有良好的复制能力,rAI4-penton和rAI4-fiber2在鸡胚尿囊液的HA效价分别为9log2和7log2,EID50分别为1.5×108/ml和3.2×107/ml,病毒生长曲线测定结果表明重组病毒与载体病毒具有相似的生长动力学特性。重组病毒在鸡胚中连续传5代后仍能表达外源蛋白,显示出了较好的遗传稳定性。将重组病毒rAI4-penton和rAI4-fiber2以106EID50/只的剂量滴鼻点眼免疫SPF鸡,免疫后3周,重组病毒rAI4-penton免疫组可以检测到针对禽腺病毒的中和抗体,中和效价为1:64,攻毒后重组病毒rAI4-penton对免疫鸡能提供有效的保护效力。上述研究为禽腺病毒重组活载体疫苗的研制提供了有益参考。(本文来源于《扬州大学》期刊2018-05-01）
李林涛,温国元,张万坡[7]（2017）在《表达禽腺病毒4型五邻体基质蛋白的重组耐热新城疫病毒的构建》一文中研究指出研究目的:禽腺病毒(fowl adenovirus FAdV)属禽腺病毒科禽腺病毒属,包括12个血清型,其中血清型4型可导致心包积水综合征(hydropericardium-hepatitis syndrome HHS)。该病发病急,传播快,雏鸡死亡率高,13年在我国首次报导,15年多地爆发,给养禽业造成重大损失。疫苗免疫是目前防控该病较好的方法,有文献报道,病毒衣壳蛋白五邻体基质(penton(本文来源于《中国兽医病理学2017年学术研讨会暨兽医病理学分会第九次全国会员代表大会论文集》期刊2017-07-28）
刘超,侯磊,韦莉,王菁,全荣[8]（2017）在《禽腺病毒4型鞭毛重组蛋白的原核表达及其免疫效果研究》一文中研究指出为研究禽腺病毒4型重组鞭毛-fiber2蛋白免疫保护性,将鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因与禽腺病毒4型的fiber2基因融合,再将融合基因和单独的fiber2基因分别克隆到原核表达载体p ET-28a,后将构建的p ET-28a-flagellin-fiber2和p ET-28a-fiber2重组载体分别转入大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物,再将表达产物纯化后免疫21日龄SPF鸡;结果表明,重组菌在37℃培养条件下1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h可表达最多的可溶性重组蛋白,Western Blot分析表明,所表达的重组蛋白均能与禽腺病毒血清4型感染阳性血清发生特异性反应,说明所表达蛋白具有良好反应原性,动物试验表明,表达的两种目的蛋白能为鸡提供一定保护力,且低剂量的重组鞭毛-fiber2蛋白产生较好的免疫保护效果。(本文来源于《中国兽医杂志》期刊2017年05期）
罗思思[9]（2011）在《Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及重组蛋白ELISA鉴别诊断方法的研究》一文中研究指出禽腺病毒(FAV)归为腺病毒科禽腺病毒属,根据抗原性差异,分为3个群。I群禽腺病毒(FAVI)具有共同的群抗原,共12个血清型(FAV1-FAV12),在鸡、鸭、鹅体内普遍存在,呈隐性感染,与其他病原共同作用于家禽。2008-2010年从广西南宁市活禽市场采集259份样品,通过SPF鸡胚传代增殖与PCR鉴定,分离到92份FAV,阳性率为35.5%(92/259)。选取不同年份的8株,进行血凝性、免疫琼脂扩散、形态学、致细胞病变和鸡胚致病性试验。结果显示,8株均不凝集鸡红细胞,能与FAVI阳性血清反应,具有腺病毒粒子的典型特征,致细胞变圆、折光性增强,使鸡胚发育不良。克降8株hexon基因,经序列分析,均与FAVI同源性最高。经遗传进化分析,均与FAVI亲缘关系最近,结果表明,8株分离株为FAVI。根据GenBank中FAVI hexon、penton、100K、33K基因序列,设计引物,经PCR扩增,与pGEX-4T-1载体连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,经IPTG诱导,表明四种重组蛋白得到良好表达；经可溶性分析,表明hexon、penton表达产物以包涵体的形式存在,100K、33K表达产物以可溶性的形式存在；经纯化,表明四种重组蛋白达到了较高的纯度和浓度；经western-blot检测,具有良好的反应原性,可作为间接ELISA的诊断抗原。以hexon和penton结构蛋白分别作为包被抗原,建立检测FAVI抗体的间接hexon-ELISA和penton-ELISA力法。结果农明,抗原最适包被浓度分别为1O.Oug/mL和15.0ug/mL；一抗血清和最适稀释度均为1：100；酶标二抗最适稀释度均为1：2000；一抗和二抗最适作用时间均分别为75min和45min。两种ELISA方法具有良好的特异性、敏感性、重复性。以不同比例的hexon、penton两种蛋白混合包被,建立hexon-penton-ELISA方法。用叁种ELISA方法检测野毒感染和灭活苗免疫血清各30份,结果表明两种血清均有反应,hexon-penton-ELISA灵敏度更高。用叁种ELISA方法检测临床样品100份,阳性率分别为45%、41%、48%。为FAVI抗体的检测和流行病学调查提供简便、快速的血清学诊断方法。以100K和33K非结构蛋白分别作为包被抗原,建立检测FAVI抗体的间接100K-ELISA和33K-ELISA方法。结果表明,抗原最适包被浓度分别为10.8u∥mL和12.0u∥mL；一抗血清最适稀释度均为1：100；酶标二抗最适稀释度均为1：3000；一抗和二抗最适作用时间均分别为60min和45min。两种方法具有良好的特异性、敏感性、重复性。以不同比例的100K、33K两种蛋白混合包被,建立间接100K-33K-ELISA方法。J1j叁种ELISA方法检测野毒感染和灭活苘免疫_I『n.消符30份,表明100K-33K-ELISA灵敏度更高。用叁种ELISA方法检测临床样l ul 100份,15I…j率分别为40%、35%、42%。该方法可检出FAVI野毒感染血消,而与火活苘免疫血消无反应,为该病的诊断与净化提供技术支撑。(本文来源于《广西大学》期刊2011-06-01）
张明明,秦爱建,庄骁颖,王小辉[10]（2010）在《CAG和MLP启动子控制的重组禽腺病毒构建》一文中研究指出根据鸡胚致死孤儿病毒(CELOV)的序列设计引物,通过PCR方法扩增了禽腺病毒FAVI-JS株的晚期启动子(MLP),序列与CELOV的MLP同源性为99%。分别构建了MLP和商品化启动子CAG控制的表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的禽腺病毒转移载体。通过载体与禽腺病毒FAVI-JS株在原代鸡胚肾细胞内进行同源重组,分别获得了MLP和CAG控制的表达eGFP的重组禽腺病毒,为探讨不同启动子对禽腺病毒活载体疫苗免疫效果的影响提供了条件。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2010年03期）
重组禽腺病毒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
肝炎-心包积水综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)是由禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus 4,FAdV-4)引起的以肝炎、心包积水为特征的疾病。自2015年以来,HHS在我国大面积流行,给我国养禽业造成了严重的经济损失。然而关于FAdV-4的毒力基因则研究较少。为探讨ORF17基因对FAdV-4复制和毒力的影响,本研究以FAdV-4流行毒株HN/15102株为亲本病毒,采用同源重组技术构建ORF17基因缺失的重组病毒。首先将表达EGFP的pΔORF17-EGFP转染已感染HN/151025的鸡肝癌细胞(LMH),构建重组病毒rHN-ΔORF17-EGFP。再将EGFP表达盒去除,经蚀斑反向筛选获得rHN-ΔORF17。将rHN-ΔORF17在LMH细胞上连续传代20代,每5代进行PCR检测,结果表明rHN-ΔORF17遗传稳定。生长动力学曲线测定结果表明2株重组病毒与亲本病毒的生长动力学趋势基本一致,均在接种后96 h病毒滴度达到高峰。rHN-ΔORF17与亲本病毒HN/151025病毒滴度相近,分别为2.22×10~8 PFU/mL和4.26×10~8 PFU/mL,表明ORF17基因缺失不影响病毒复制能力;而rHN-ΔORF17-EGFP滴度显着下降(1.53×10~6PFU/mL)与亲本病毒HN/151025差异显着(P<0.05)。中国分离株FAdV-4与加拿大ON1弱毒株相比,基因组3′端缺失1966-bp序列(ORF19和ORF27),为了解该自然缺失对病毒毒力的影响,本研究以基因组3′端35430-35431位点自然缺失1966-bp序列的HN/151025为亲本病毒,构建表达EGFP的重组病毒rHN-Δ35430-EGFP。然后将1966-bp序列替换EGFP表达盒,构建补足ON1株来源的1966-bp序列的重组病毒rHN-Δ35430-ON1。rHN-Δ35430-ON1在LMH细胞上连续传代20代,每5代进行PCR检测,结果表明rHN-Δ35430-ON1遗传稳定。重组病毒生长动力学曲线测定结果表明2株重组病毒与亲本病毒的复制动力学趋势基本一致,均在接种后96 h病毒滴度达到高峰。rHN-Δ35430-EGFP滴度为6.8×10~7PFU/mL,rHN-Δ35430-ON1滴度(2.66×10~8 PFU/mL)与亲本病毒HN/151025(4.26×10~8 PFU/mL)相近,说明插入1966-bp序列不影响病毒复制。对rHN-ΔORF17和rHN-Δ35430-ON1进行致病性评价。将40只28日龄SPF鸡随机分成4组,其中3组分别用rHN-ΔORF17、rHN-Δ35430-ON1和HN/151025通过滴鼻点眼途径进行攻毒,攻毒剂量为0.1 mL 8×10~5 PFU,对照组为等体积无菌PBS,攻毒后观察鸡只症状。攻毒后第3 d,rHN-ΔORF17和HN/151025组鸡只开始出现临床症状,rHN-Δ35430-ON1组鸡只于攻毒后第4 d出现临床症状,发病鸡只表现为精神沉郁、缩脖、羽毛蓬乱、喜卧嗜睡等;攻毒组发病率均为100%,发病高峰期均在攻毒后第4~6 d,攻毒后第14 d各组鸡只逐渐开始康复。攻毒组中,HN/151025组死亡率为10%,rHN-ΔORF17组死亡率为20%,rHN-Δ35430-ON1组死亡率为10%,对照组为0。对死亡鸡只进行病理剖检,攻毒组均表现心包积液、肝脏黄色坏死灶、肾肿大,无明显差异。免疫组化攻毒组肝脏均检测到抗原。攻毒后第4~28 d,每4 d采集咽肛拭子和血清抗体。咽肛拭子排毒检测中,3组攻毒组鸡只均在第4~20 d检测到100%排毒,第24 d排毒下降,3组表现一致。血清抗体检测中,整体抗体水平无差异,仅在抗体阳转率存在差异。HN/151025组阳转率最高达88.9%,rHN-ΔORF17组阳转率最高为50%,rHN-Δ35430-ON1阳转率最高为33.3%。在第32 d进行第2次攻毒,3组均无明显临床症状。抗体阳转率也无明显差异。咽肛拭子排毒,第4~27d排毒率100%,第34~55 d下降后上升,在第62 d排毒率达100%,3组表现一致,无明显差异,且均排毒反复,排毒期长。上述结果表明,2株重组病毒对鸡的致病性与亲本病毒差异不显着。综上,ORF17基因缺失和插入自然缺失1966-bp序列对病毒复制和致病性均无影响。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
重组禽腺病毒论文参考文献
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