利用农业副产品发酵坚强芽孢杆菌及其用于加强生物絮团培养的研究

论文摘要

九十年代后,中国的对虾养殖业在政府、研究人员和养殖者等多方的努力下,在世界范围内得到了快速的发展,成为世界对虾养殖第一大国。近年来,益生菌的作用在养殖过程中越来越受到关注,人们通过利用益生菌来达到改善水体环境、抑制病原菌生长、提高养殖动物免疫力等作用,益生菌的广泛使用已经创造了巨大的经济效益。生物絮团是含有大量微生物的团块,含有大量益生菌的生物絮团具有良好的效果和应用价值。本试验以从对虾肠道分离的一种有益菌---坚强芽孢杆菌为对象,主要针对生物絮团养殖技术所需要的池边微生物发酵技术开展研究,降低成本的前提下,采用玉米粉、麦麸、秸秆、豆粕、花生粕等低值农业原料作为基础培养基,通过正交试验研究微生物发酵技术所需培养基的最佳配方;通过单因素探讨研究不同发酵条件对菌体生长的影响。为水产养殖技术提供理论依据及核心技术支持。生物絮团健康养殖技术解决高密度养殖所造成的废水污染和水体环境恶化问题方面越来越受到人们的关注,近年来很多研究集中在生物絮团的更多价值,尤其在病原控制方面。在本实验中,通过向培养絮团的水体中添加坚强芽孢杆菌和必要的碳源和氮原,达到控制生物絮团优势菌群的目的,并通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术研究坚强芽孢杆菌提高的生物絮团的微生物多样性及培养过程中微生物群落结构的变化,通过分析不添加坚强芽孢杆菌的对照组和添加坚强芽孢杆菌的实验组微生物群落结构的差异性,分析坚强芽孢杆菌在生物絮团形成过程中对其它菌群的影响。利用农业副产品生产坚强芽孢杆菌发酵工艺的研究实验表明:采用小麦秸秆、麦麸、玉米粉、花生粕、豆粕作为发酵培养基基质,小麦秸秆、麦麸、花生粕的搭配适合坚强芽孢杆菌的生长,秸秆1.8%、麦麸4%、花生粕0.6%为最佳配方,最佳发酵条件为初始pH值6.0,温度36℃,装液比为1:2,发酵时间为60h。利用DGGE技术分析坚强芽孢杆菌加强的生物絮团微生物多样性研究中,结果表明:以秸秆、麦麸、花生粕培养的坚强芽孢杆菌为添加菌,再添加必要的碳源和氮源,在30℃充氧条件下,生物絮团在试验组前四天的形成量很低,但从第4d开始絮团的生成速度明显加快,并从第7d开始絮团量基本达到最大值,在以后的几天絮团都稳定在这个值。而作为不添加菌液的对照组,水体在培养3d后虽然开始变得浑浊,但一直没有絮团形成,直至第6d,对照组形成较小的絮状团,但密度较小,漂浮于水体中。在本实验中,利用DGGE技术将对照组和实验组生物絮团微生物多样性进行研究,结果表明:在生物絮团形成过程中海水中的一些优势菌群出现条带最终消失的现象,这说明在在絮团形成过程中,出现微生物的竞争生长。在对照组和实验组对照试验中,发现有差异性条带,这表明在此条件下,坚强芽孢杆菌的加入可能影响了微生物群落结构的变化。将DGGE结果中具有代表性条带中DNA进行TA克隆后测序,测序结果显示生物絮团中含有假单胞杆菌属、疣微菌门、圆杆菌属、嗜藻菌属等微生物,而且还含有许多海水中的未知菌,并在实验室组中含有添加的坚强芽孢杆菌。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 0 前言
• 1 芽孢杆菌在水产养殖的应用研究进展
• 1.1 改善水体环境
• 1.2 促进养殖动物的生长
• 1.3 改善养殖动物免疫系统
• 1.4 抑制病原菌的生长
• 1.5 展望
• 2 DGGE 技术在微生物多样性研究中的应用
• 2.1 DGGE 的原理
• 2.2 DGGE 电泳技术的发展及应用
• 2.2.1 DGGE 技术在水产养殖微生物生态学中的应用
• 2.2.2 DGGE 技术在环境微生物生态学中的应用
• 2.2.3 DGGE 技术在肠道微生物研究中的应用
• 2.2.4 DGGE 技术在极端环境微生物分析中的应用
• 2.3 DGGE 技术的流程
• 2.4 影响DGGE 最终结果的因素
• 2.4.1 样品总DNA 的提取及纯化
• 2.4.2 样品DNA 的PCR 反应
• 2.4.3 电泳胶的浓度及变性剂浓度范围
• 2.4.4 电泳温度和时间
• 2.5 DGGE 技术的发展前景
• 第一章 利用农业副产品生产坚强芽孢杆菌发酵工艺的研究
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 菌株和培养基
• 1.1.2 坚强芽胞杆菌的计数
• 1.1.3 发酵培养基成分的筛选
• 1.1.4 发酵培养基的优化
• 1.1.5 发酵条件的优化
• 1.1.6 养殖场用发酵时间的优化
• 1.1.7 可溶性糖的测定
• 1.2 结果
• 1.2.1 发酵培养基成分的筛选
• 1.2.2 发酵培养基的优化
• 1.2.3 温度对菌株生长的影响
• 1.2.4 初始pH 值对菌株生长的影响
• 1.2.5 装液率对菌体生长量的影响
• 1.2.6 发酵时间的优化
• 1.2.7 可溶性糖的测定
• 1.3 小结与讨论
• 第二章 利用 PCR-DGGE 技术对生物絮团微生物多样性的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与培养基
• 2.1.2 生物絮团的培养
• 2.1.3 生物絮团生成量的测定
• 2.1.4 样品的采集和保存
• 2.1.5 生物絮团基因组DNA 的提取及浓度的测定
• 2.1.6 16SrDNA 的PCR 扩增
• 2.1.7 DGGE 电泳所需部分试剂的配制
• 2.1.8 变性胶的配制
• 2.1.9 DGGE 电泳基本步骤
• 2.1.10 银染法显色
• 2.1.11 分离条带并进行PCR 扩增
• 2.1.12 目的片段的TA 克隆
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 生物絮团的培养
• 2.2.2 16SrDNA V3 区扩增产物电泳图谱
• 2.2.3 V3 区扩增产物的DGGE 图谱
• 2.2.5 特异性条带的 TA 克隆
• 2.2.6 测序
• 2.2.7 测序结果分析
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 总结
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢