棉花组织特异性DNA甲基化及海岛棉种内甲基化多态性分析

论文摘要

DNA胞嘧啶甲基化是棉花生长发育和组织分化过程中一种非常重要的表观遗传现象,不同材料或同一材料的不同组织能够通过改变DNA甲基化的模式来调控基因的表达。本研究采用甲基化敏感性扩增多态性（MSAP）技术,对Pima3-79和鄂棉22开花期幼叶、老叶、苞叶、纤维DNA的5′-CCGG-3′位点的胞嘧啶甲基化进行分析。并探讨了海陆杂种相对其亲本的甲基化差异。同时首次基于甲基化多态性对海岛棉系统聚类,并将甲基化多态性聚类与序列多态性聚类结果进行了比较分析。MSAP结果显示:1.组织特异性甲基化分析采用88对引物组合,扩增出5321条清晰的带型,对其中的663（12.5%）条在鄂棉22或Pima3-79中表现甲基化的片段予以记录整理分析发现:对于鄂棉22,四个不同组织具有相同甲基化模式的片段有618（93.3%）,而组织特异性胞嘧啶甲基化仅有45（6.7%）;Pima3-79三个不同组织具有相同甲基化模式的片段有616（92.9%）,而组织特异性胞嘧啶甲基化仅有47（7.1%）;说明棉花组织特异性甲基化水平很低。2.杂交种相对双亲,发生了广泛的胞嘧啶甲基化变化,这种变化包括超甲基化和去甲基化同时还包括甲基化类型的潜在转变（如从外部胞嘧啶甲基化到内部胞嘧啶甲基化的转变或从内部胞嘧啶甲基化到外部胞嘧啶甲基化的转变）;去甲基化位点数（63.9%）高于超甲基化位点数（6.1%）。3.海岛棉甲基化多态性分析得到117个甲基化位点,其中甲基化多态性位点31（26.5%）个,利用24个表现较高的重复性和可信度的甲基化多态性位点数据对28份材料聚类,聚类图将陆地棉,海岛棉及其杂种很好的分离开来,甲基化聚类的平均相似系数（0.67）明显高于先前已有的SRAP序列聚类平均相似系数（0.48）,说明海岛棉间的甲基化差异远小于序列差异。同时发现Pima3-79、Pima90、比马棉1和苏丹2B甲基化多态性聚类与SRAP序列聚类结果较相似,未发现其它系列海岛棉两种聚类结果的相关性。4.7个甲基化位点测序发现:有5个与已知的功能基因相匹配,它们分别是雷蒙德氏棉转座子类似增变子、细胞色素氧化酶亚单位Ⅲ、DNA修复酶RecA基因、毒素前体蛋白基因Hfr-2 mRNA;还有2个位点与Zhao等（2008）报道的利用MSAP研究棉花甲基化与杂种优势关系所得的序列高度匹配,数据库中无相似序列的功能报道。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 植物表观遗传与DNA甲基化
• 1.3 DNA甲基化的生物学意义
• 1.3.1 DNA甲基化在基因表达调控中的重要作用
• 1.3.1.1 DNA甲基化与春化作用
• 1.3.1.2 DNA甲基化与亲本印迹
• 1.3.1.3 DNA甲基化与杂种优势
• 1.3.1.4 DNA组织和物种特异性甲基化
• 1.3.2 DNA甲基化在维持基因组的稳定性起重要作用
• 1.3.2.1 DNA甲基化与转基因沉默
• 1.3.2.2 DNA甲基化与转座子失活
• 1.4 DNA甲基化的研究方法
• 1.4.1 基因组整体水平甲基化分析
• 1.4.2 特异性位点的DNA甲基化的检测
• 1.4.3 MSAP技术在DNA甲基化检测中的应用
• 1.5 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 棉花基因组DNA的提取与纯化
• 2.2.2 甲基化敏感性扩增片段长度多态性（MSAP）分析
• 2.2.2.1 限制性酶切及连接
• 2.2.2.2 预扩增
• 2.2.2.3 选择性PCR扩增
• 2.2.3 多态性甲基化片段的回收、克隆及测序
• 2.2.3.1 回收
• 2.2.3.2 回收片段的再扩增及检测
• 2.2.3.3 TA克隆
• 2.2.3.4 测序及序列分析
• 2.2.4 数据分析
• 2.2.4.1 带型记录
• 2.2.4.2 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 棉花组织特异性甲基化分析
• 3.1.1 鄂棉22组织特异性甲基化
• 3.1.2 Pima3-79组织特异性甲基化
• 3.1.3 杂种及亲本的甲基化分析
• 3.2 海岛棉甲基化多态性分析
• 4 讨论
• 4.1 组织特异性胞嘧啶甲基化
• 4.2 甲基化与杂种优势
• 4.3 海岛棉亚种内的甲基化多态性
• 参考文献
• 附录
• 1 棉花DNA的抽提
• 1.1 大量棉花DNA的抽提
• 1.2 DNA浓度的测定
• 2 TA克隆的步骤
• 2.1 PCR产物的连接
• 2.2 连接产物的转化
• 2.2.1 转化所需试剂
• 2.2.2 转化过程
• 2.2.3 挑白斑
• 2.2.4 阳性克隆的PCR鉴定
• 致谢