论文摘要
随着全球一体化和国际社会交往与贸易往来的与日俱增,外来有害生物随人口流动、动植物及其产品跨国扩散日益严重,给入侵地生态系统和国土安全造成巨大的灾害性损失。松材线虫（Bursaphelenchu xylophilus （Steiner & Buhrer） Nickle）已经成为世界上重要的检疫对象和我国有史以来危害最为严重的林业外来有害生物。基于经典与现代生物学的理论与方法,国内外众多学者对松材线虫的生物学、生态学和致病性等进行了深入研究,但是迄今尚未有有效控制措施。本研究基于前人对松材线虫致病过程中纤维素酶的认识,研究分析松材线虫和近似种拟松材线虫（B. mucronatus）分泌的纤维素酶系组成,纤维素酶系活力与线虫迁移扩散能力的关系,以及纤维素酶相关编码基因的克隆与功能鉴定,意图阐明纤维素酶在松材线虫致病过程中的分子机制,为松材线虫病的可持续控制提供理论基础。采用真菌平板培养法研究了不同松材线虫和拟松材线虫株系的繁殖能力。在灰葡萄孢上培养10d,松材线虫和拟松材线虫繁殖倍数分别达到248倍和373倍,而在松球壳孢上培养10d,松材线虫和拟松材线虫繁殖倍数分别为133和98倍。结合性比及幼虫/成虫指标数据,结果表明,在本实验室条件下,线虫在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）上繁殖速度最快,繁殖后得到合适数量的混合龄期线虫;以反映线虫繁殖能力的三个指标:繁殖倍数、性比和幼虫/成虫分析比较了供试的6个松材线虫株系和4个拟松材线虫株系,以松材线虫Bx02、Bx03和拟松材线虫Bm01表现较高的繁殖能力。分别采用羧甲基纤维素钠（CMC）、微晶纤维素（MC）和水杨素（SC）三种底物,结合DNS定量分析法,研究了松材线虫和拟松材线虫体外分泌物中内切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三类酶的活性。结果表明,在离体培养条件下,松材线虫和拟松材线虫均能产生包括三类酶的完整纤维素酶系。其中,松材线虫分泌物中三类酶活性明显高于拟松材线虫分泌物中这三类酶活性。在内切-β-1,4-葡聚糖酶中,松材线虫Bx01株系的酶活性最高为9.36μg·ml-1·min-1,拟松材线虫Bm03株系的酶活性最高是6.32μg·ml-1·min-1,前者酶活性是后者的1.48倍;外切-β-1,4-葡聚糖酶酶活性最高的松材线虫Bx01是6.67μg·ml-1·min-1,酶活性最高的拟松材线虫Bm03是4.22μg·ml-1·min-1,前者是后者的1.58倍;Β-葡萄糖苷酶活性最高的松材线虫Bx02株系为7.35μg·ml-1·min-1,最高的拟松材线虫Bm01株系为4.63μg·ml-1·min-1,前者是后者酶活性的1.59倍。方差分析和多重比较结果表明,松材线虫Bx01、Bx02、Bx04、Bx05和Bx06株系内切-β-1,4-葡聚糖酶活性同所有拟松材线虫株系相比,结果达到极显著差异。结合二者致病力的显著差异,研究结果为更好的解释松材线虫致病机理提供了科学数据。通过人工接种方法,比较了供试松材线虫和拟松材线虫株系在黑松枝段内的迁移扩散和繁殖能力。结果表明,与拟松材线虫相比,松材线虫在黑松枝段内迁移能力更强,表现在以更快的速度和更大的种群数量穿过黑松枝段。多数松材线虫株系在黑松枝段内的繁殖力高于拟松材线虫,并且多数松材线虫株系繁殖数量同其中三个拟松材线虫株系繁殖数量差异显著。结合松材线虫株系分泌的纤维素酶系活性明显高于拟松材线虫株系的纤维素酶系,纤维素酶可能是线虫在寄主体内迁移扩散的主要驱动力之一。以松材线虫总RNA为模板,运用RT-PCR技术分离和克隆了编码松材线虫纤维素酶系组分之一的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因的cDNA片段（GenBank注册号为EU660207）。经T载体克隆、酶切鉴定和序列测定获得cDNA片段为一个长678bp的完整的开放阅读框,编码全长为225个氨基酸的蛋白,同GenBank数据库中已登录的日本松材线虫内切-β-1,4-葡聚糖酶基因表现出较高的同源性,相似性为95%。用生物信息学方法分析和预测了编码蛋白质的主要特性。同源性分析表明,该蛋白同真菌中糖基水解酶相似性比较高,同植物寄生线虫和细菌的糖基水解酶相似性较低,证明该基因是来自真菌的水平基因漂移（HGT）。进一步运用RANi技术鉴定了松材线虫内切-β-1,4-葡聚糖酶基因的功能。荧光显微镜观察结果表明,溶液浸泡可以把siRNA成功导入松材线虫体内,产生基因沉默效应。采用荧光定量PCR技术检测松材线虫内切-β-1,4-葡聚糖酶基因mRNA水平的表达抑制效应发现,siRNA15和siRNA275的沉默效率最高,siRNA581沉默基因的效率最低。生物学效应分析结果表明,siRNA松材线虫处理后,松材线虫分泌物中纤维素酶活性显著下降,说明松材线虫β-1,4-葡聚糖酶基因的表达受到明显抑制。同时,松材线虫种群繁殖力明显降低,穿过黑松枝段的时间明显延长,说明松材线虫内切-β-1,4-葡聚糖酶可能对松材线虫生长发育和运动扩散能力也有一定的影响。