不结球白菜抗真菌病基因的克隆与表达分析

论文摘要

利用已知抗真菌蛋白基因的保守序列设计引物,获得了不结球白菜重要的抗真菌蛋白基因,为转基因研究、增强不结球白菜抗真菌病害奠定了基础。同时,利用cDNA-AFLP技术,从病原菌诱导处理的不结球白菜中筛选到一个重要的几丁质酶基因片段,通过RT-PCR和RACE技术,获得了该基因cDNA全长序列,序列分析发现与已知的不结球白菜几丁质酶基因具有较低的同源性。1.不结球白菜几丁质酶基因cDNA全长的克隆与诱导表达分析利用已发表的油菜几丁质酶基因序列设计引物,以不结球白菜抗霜霉病自交系‘苏州青’为实验材料,通过RT-PCR和RACE技术,获得了不结球白菜几丁质酶基因的cDNA全长序列,命名为Bcchi,将该序列提交DDBJ,登录号为AB302323。序列分析发现,不结球白菜Bcchi基因核苷酸序列全长1068bp,编码268个氨基酸残基,其中包含24个氨基酸构成的信号肽,推导蛋白的分子量为28.7kD,等电点（pI）为8.28。Bcchi推导的氨基酸序列与油菜ChB4基因具有100%的同源性,与大白菜CHB4基因具有99%的同源性,与其它植物几丁质基因的同源性为59%-78%。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于一个。实时定量PCR和Northern blot分析表明,该基因有低水平的组成型表达,霜霉病菌诱导处理后,叶片中该基因表达量迅速增加。组织表达特异性分析表明,霜霉病诱导24h后,该基因诱导表达最高的部位是叶片。数据表明该基因有可能参与植物对病原菌侵染的抗性反应。2.不结球白菜植物防卫素基因cDNA全长的克隆与诱导表达分析利用已发表的植物抗真菌蛋白和防卫素基因序列设计引物,以不结球白菜抗病自交系‘苏州青’为实验材料,通过RT-PCR和RACE技术,获得了不结球白菜植物防卫素基因的cDNA全长序列,命名为BcAF,将该序列提交DDBJ,登录号为AB302324。序列分析发现,不结球白菜BcAF基因核苷酸序列长450bp,编码79个氨基酸残基,其中包含29个氨基酸构成的信号肽,推导蛋白的分子量为8.56kD,等电点（pI）为8.15。BcAF推导的氨基酸序列与油菜AFP3基因（GenBank登录号AAB03224）具有100%的同源性,与萝卜AFP3（EMBL登录号CAA65984）基因具有96%的同源性,与其它植物防卫素基因的同源性为82%-88%。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于一个。实时定量PCR和Northern blot分析表明,该基因有低水平的组成型表达,霜霉病菌诱导处理后叶片中表达量迅速增加。组织表达特异性分析表明,霜霉病诱导12h后,该基因诱导表达最高的部位是叶片。数据分析表明该基因可能参与植物对病原菌侵染的抗性反应。3.不结球白菜BcPR4基因cDNA全长的克隆与诱导表达分析利用已发表的大白菜PR4基因序列设计引物,以霜霉病病原菌诱导处理后的不结球白菜‘苏州青’为实验材料,通过RT-PCR和RACE技术,获得了不结球白菜PR4基因的cDNA全长序列,命名为BcPR4,将该序列提交DDBJ,登录号为AB325873。序列分析发现,不结球白菜BcPR4基因核苷酸序列全长637bp,编码140个氨基酸残基,其中包含21个氨基酸构成的信号肽,推导蛋白的分子量为15.5kD,等电点为8.13。不结球白菜PR4蛋白与大白菜PR4基因氨基酸序列的同源性为100%,与其它植物PR4基因氨基酸序列同源性为63-75%。Southern杂交分析表明该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于1个。实时定量PCR分析表明,SA和霜霉病菌诱导处理后24h和48h,该基因的表达量达到高峰。数据分析表明该基因可能参与对病原菌侵染的抗性反应。4.不结球白菜新型几丁质酶基因的克隆与表达分析利用cDNA-AFLP技术,我们从不结球白菜中获得了一个受真菌诱导的几丁质酶基因。该基因是从霜霉病菌诱导的叶片mRNA中分离到的。在对侵染过程进行检测的时候,我们发现一个未在对照植株叶片中转录表达,却在Peronospora parasitica诱导12h以后的叶片中转录表达的特异片段,通过RT-PCR和RACE技术,获得了该基因全长序列。序列分析发现,该基因为典型的几丁质酶基因。该基因核苷酸序列长1070bp,编码278个氨基酸残基,其中包含30个氨基酸构成的信号肽,推导蛋白的分子量为30kDa,等电点（pI）为8.92。推导的氨基酸序列与其它几丁质酶蛋白同源性较低,命名为Bcenchi,将该序列提交DDBJ,登录号为AB369105。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于一个。实时定量PCR法对两种真菌（霜霉病菌和黑斑病菌）以及两种信号传导物质SA和茉莉酸甲酯（MeJA）诱导该基因表达进行分析。结果表明Bcenchi参与寄主对病原菌侵染的抗性反应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物抗病性以及病程相关蛋白基因的研究进展
• 1.植物抗病性研究进展
• 1.1 植物抗病性的反应
• 1.2 植物抗病性的鉴定
• 1.3 植物抗病性的机制
• 2.植物病程相关蛋白基因的研究进展
• 2.1 PR基因的类型
• 2.2 PR基因的表达
• 2.3 PR蛋白的功能
• 3.植物抗病基因克隆方法研究进展
• 3.1 图位克隆
• 3.2 转座子标签法
• 3.3 功能基因克隆
• 3.4 差异显示
• 3.4.1 差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）
• 3.4.2 cDNA代表性差异分析（RDA）
• 3.4.3 抑制性扣除杂交技术（SSH）
• 3.4.4 cDNA-AFLP技术
• 3.4.5 RACE技术
• 参考文献
• 第二部分 研究报告
• 第二章 不结球白菜几丁质酶基因Bcchi的克隆与表达分析
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 植物材料的准备
• 1.2.2 接种液制备及接种方法
• 1.2.3 基因组DNA,总RNA的提取
• 1.2.4 单链cDNA的合成
• 1.2.5 引物的设计
• 1.2.6 PCR扩增
• 1.2.7 3'RACE
• 1.2.8 5'RACE
• 1.2.9 目的片段的回收及克隆
• 1.2.10 质粒的提取及重组质粒的鉴定
• 1.2.11 序列测定及分析
• 1.2.12 Southern杂交分析
• 1.2.13 Northern杂交分析
• 1.2.14 Bcchi基因杂交探针的制备
• 1.2.15 实时定量PCR分析
• 2.结果与分析
• 2.1 不结球白菜总RNA的提取
• 2.2 不结球白菜Bcchi基因cDNA全长的克隆
• 2.2.1 不结球白菜Bcchi基因cDNA中间片段RT-PCR的扩增
• 2.2.2 3'RACE
• 2.2.3 5'RACE
• 2.3 不结球白菜Bcchi基因cDNA全长的拼接及序列分析
• 2.4 不结球白菜Bcchi基因的同源性分析
• 2.5 Southern杂交检测Bcchi基因的拷贝数
• 2.6 霜霉病菌接种处理对不结球白菜Bcchi基因表达的影响
• 2.6.1 不结球白菜Bcchi基因表达的Northern杂交分析
• 2.6.2 不结球白菜Bcchi基因表达的实时定量PCR分析
• 3.讨论
• 参考文献
• 第三章 不结球白菜植物防卫素基因BcAF的克隆与表达分析
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 植物材料的准备
• 1.2.2 接种液制备及接种方法
• 1.2.3 基因组DNA,总RNA的提取
• 1.2.4 单链cDNA的合成
• 1.2.5 引物的设计
• 1.2.6 PCR扩增
• 1.2.7 3'RACE
• 1.2.8 5'RACE
• 1.2.9 目的片段的回收及克隆
• 1.2.10 序列测定及分析
• 1.2.11 Southern杂交分析
• 1.2.12 Northern杂交分析
• 1.2.13 BcAF基因杂交探针的制备
• 1.2.14 实时定量PCR分析
• 2.结果与分析
• 2.1 不结球白菜总RNA的提取
• 2.2 不结球白菜BcAF基因cDNA全长的克隆
• 2.2.1 不结球白菜BcAF基因cDNA中间片段RT-PCR的扩增
• 2.2.2 3'RACE
• 2.2.3 5'RACE
• 2.3 不结球白菜BcAF基因cDNA全长的拼接及序列分析
• 2.4 不结球白菜BcAF基因的同源性分析
• 2.5 Southern杂交检测BcAF基因的拷贝数
• 2.6 霜霉病菌接种处理对不结球白菜BcAF基因表达的影响
• 2.6.1 不结球白菜BcAF基因表达的Northern杂交分析
• 2.6.2 不结球白菜BcAF基因表达的实时定量PCR分析
• 3.讨论
• 参考文献
• 第四章 不结球白菜PR4蛋白基因的克隆与表达分析
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 植物材料的准备
• 1.2.2 接种液制备及接种方法
• 1.2.3 基因组DNA,总RNA的提取
• 1.2.4 单链cDNA的合成
• 1.2.5 引物的设计
• 1.2.6 PCR扩增
• 1.2.7 3'RACE
• 1.2.8 5'RACE
• 1.2.9 目的片段的回收及克隆
• 1.2.10 序列测定与分析
• 1.2.11 Southern 杂交
• 1.2.12 实时定量RT-PCR分析方法
• 2.结果与分析
• 2.1 不结球白菜总RNA的提取
• 2.2 不结球白菜BcPR4基因cDNA全长的克隆
• 2.2.1 不结球白菜BcPR4基因cDNA片段的RT-PCR扩增
• 2.2.2 3'RACE
• 2.2.3 5'RACE
• 2.3 不结球白菜BcPR4基因cDNA全长的拼接及序列分析
• 2.4 不结球白菜BcPR4基因的同源性分析
• 2.5 Southern杂交检测BcPR4基因的拷贝数
• 2.6 不结球白菜BcPR4基因表达的实时定量PCR分析
• 2.6.1 实时定量标准曲线
• 2.6.2 SA和P.parasitica诱导不结球白菜BcPR4基因表达
• 3.讨论
• 参考文献
• 第五章 不结球白菜新型几丁质酶基因的克隆与表达分析
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 植物材料的准备
• 1.2.2 接种液和诱导液制备以及诱导程序
• 1.2.3 基因组DNA,总RNA的提取
• 1.2.4 去除总RNA中痕量DNA污染
• 1.2.5 双链cDNA的合成
• 1.2.6 cDNA-AFLP分析
• 1.2.7 不结球白菜Bcenchi基因克隆与表达分析
• 2.结果与分析
• 2.1 不结球白菜总RNA的提取
• 2.2 链cDNA的合成与纯化
• 2.3 cDNA-AFLP显示差异结果分析
• 2.3.1 丙烯酰胺凝胶电泳结果
• 2.3.2 目的片段的克隆和测序
• 2.4 不结球白菜几丁质酶基因的克隆与序列分析
• 2.5 基因组Southern杂交分析
• 2.6 实时定量PCR分析
• 3.讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 本文创新之处
• 在读期间发表的学术论文
• 致谢