论文摘要
本文以脂质体介导法转染绵羊胎儿成纤维细胞(sFFCs),寻找影响脂质体介导转染sFFCs效率的因素,以期提高转染效率,为转基因绵羊生物反应器打下基础。首先成功建立了30天绵羊胎儿成纤维细胞培养体系及优化的转染方法,在此基础上sFFCs能传代至F30, pNIGBA质粒转染率可达到46%。根据建系要求,对sFFCs的生物学性状进行分析结果如下:1.培养细胞形态为典型的成纤维状,可根据对胰蛋白酶的敏感度不同,将其纯化。2.绵羊胎儿成纤维细胞的生长曲线均呈“S”型,细胞经历了潜伏期、指数生长期和平台期。3.细胞冷冻实验结果显示,绵羊胎儿成纤维细胞用DMSO(10%)冷冻,细胞存活状态良好,说明本研究中所采用冷冻保护剂适合于sFFCs的长期冷冻保存。4.染色体核型分析绵羊的二倍体染色体数目为2n=54,在本研究培育体系中能保持二倍体性状,遗传性状稳定,可以使绵羊遗传资源在细胞水平长久保持下来。5. Lipofectamine TMReagent能有效介导pNIGBA质粒转染sFFCs,绿色荧光蛋白基因在培养细胞中的表达,转染效率与细胞汇合度、质粒DNA和脂质体的浓度比例、转染时间及G418浓度相关。实验中当细胞汇合度达到30%～60%时,用3.0μl脂质体介导1.0μg质粒DNA转染5h,再用G418(800μg/ml)筛选一到两周即可获得满意的转染效率,转染率可达到46%。