生麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆与鉴定

论文摘要

生麦芽糖α-淀粉酶指α-淀粉酶家族中水解利用淀粉及相关多聚糖主要产物为麦芽糖的一类酶,包括麦芽糖淀粉酶、新普鲁兰酶和环状麦芽糊精淀粉酶。生麦芽糖α-淀粉酶具有多底物特性和底物优先选择性,可水解α-1,4-、α-1,6-葡萄糖苷键,作用于淀粉及环状糊精、普鲁兰多糖等相关多聚糖、寡糖,主要产物为α-麦芽糖,属于淀粉分解酶类亚族GH13。生麦芽糖α-淀粉酶主要应用于淀粉及食品工业。本研究中,根据地衣芽孢杆菌基因组序列中的麦芽糖淀粉酶基因序列和糖苷水解酶家族GH13中生麦芽糖α-淀粉酶基因的两端保守序列设计合成两对引物,分别以Bacillus licheniformis ATCC14580和Bacillus cereus CICIM-B0627染色体DNA为模板,PCR扩增得到两段不同来源的生麦芽糖α-淀粉酶基因amyM-Bl和amyM-Bc。经核苷酸序列测定,amyM-Bl序列大小为1764 bp,编码587个氨基酸,预计蛋白分子量为67.4 kDa,等电点为4.93;amyM-Bc序列大小为1685 bp,编码561个氨基酸,预计蛋白分子量为65.4 kDa,等电点为5.18。经氨基酸序列比对和蛋白质序列比对,两者都具有α-淀粉酶家族特有的高度保守的催化活性区域,其中amyM-Bl与B. licheniformis ATCC14580麦芽糖淀粉酶相一致;amyM-Bc与B. cereus ATCC14579来源的新普鲁兰酶基因具有99.29%的同源性。将amyM-Bl和amyM-Bc分别克隆入表达载体pET-28a（+）中,经IPTG诱导,在Escherichia coli BL21 （DE3）中成功实现了初步异源表达,SDS-PAGE电泳结果分别显示出分子量约为67 kDa和65 kDa的特异性蛋白质条带。发酵制备粗酶液,测定生麦芽糖α-淀粉酶活性。结果表明, amyM-Bl获得了活性表达,酶活力为3.797 U/mL;而amyM-Bc可能不适用于大肠杆菌,最终没有获得活性表达。对重组生麦芽糖α-淀粉酶AmyM-Bl的酶学性质和水解特性进行了系统分析。重组酶AmyM-Bl的最适反应温度为45℃,最适反应pH为6.5,重组酶具有良好的稳定性,能在45℃以下的中低温环境和比较宽泛的pH范围内（pH 4.58.5）保持稳定,且酶活受金属离子影响不显著。重组酶能够水解环状糊精、可溶性淀粉和普鲁兰,最适底物为环状糊精。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 前言
• 1.1 生麦芽糖α-淀粉酶的涵义及性质
• 1.1.1 淀粉水解酶的分类及α-淀粉酶家族成员
• 1.1.2 生麦芽糖α-淀粉酶的基本特性
• 1.1.3 生麦芽糖α-淀粉酶基因的细菌来源
• 1.2 生麦芽糖α-淀粉酶的应用
• 1.2.1 生麦芽糖α-淀粉酶在淀粉糖化工业方面的应用
• 1.2.2 生麦芽糖α-淀粉酶在面粉工业方面的应用
• 1.3 国内外研究进展
• 1.4 本文的主要研究内容
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要分子生物学试剂和化学试剂
• 2.1.3 常用溶液及培养基的配制
• 2.1.4 实验主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 芽孢杆菌染色体DNA 的提取
• 2.2.2 引物设计及生麦芽糖α-淀粉酶基因的扩增
• 2.2.3 生麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆
• 2.2.4 生麦芽糖α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的异源表达
• 2.2.5 粗酶液的制备
• 2.2.6 蛋白质测定和SDS-PAGE 电泳
• 2.2.7 重组酶酶活力的测定
• 2.2.8 重组酶酶学性质分析
• 2.2.9 重组酶的水解性质分析
• 2.2.10 重组蛋白复性
• 3 结果
• 3.1 B. licheniformis ATCC14580 生麦芽糖α-淀粉酶基因amyM-Bl 的克隆、表达与鉴定
• 3.1.1 amyM-Bl 的扩增
• 3.1.2 amyM-Bl 在pBlueScriptⅡSK（-）中的亚克隆
• 3.1.3 amyM-Bl 的序列测定及分析
• 3.1.4 重组表达质粒pET-28a-amyM-Bl 的构建
• 3.1.5 amyM-Bl 在E. coli BL21 （DE3）中的表达
• 3.2 重组生麦芽糖α-淀粉酶AmyM-Bl 的酶学性质分析和水解性质分析
• 3.2.1 重组酶酶活力的测定
• 3.2.2 重组酶AmyM-Bl 的基本性质
• 3.2.3 重组酶AmyM-Bl 的水解性质
• 3.3 B. cereus CICIM-80627 生麦芽糖α-淀粉酶基因amyM-Bc 的扩增、序列测定与分析
• 3.3.1 amyM-Bc 的扩增
• 3.3.2 amyM-Bc 基因的序列测定与分析
• 3.4 B. cereus CICIM-80627 生麦芽糖α-淀粉酶基因amyM-Bc 的克隆与表达
• 3.4.1 重组质粒pET-28a-amyM-Bc 的构建
• 3.4.2 amyM-Bc 在E. coli BL21 （DE3）中的表达
• 3.4.3 重组蛋白AmyM-Bc 的复性研究
• 4 讨论
• 主要研究结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文