牛结核分支杆菌外膜蛋白OMP37、OMP12基因的克隆表达及免疫活性检测

论文摘要

牛结核病是由结核分枝杆菌引起的一种人兽共患传染病。人畜结核病的交叉传播是造成结核病广泛流行的重要原因之一。由于牛与人类关系密切,致使人类结核病的10%以上是由牛分枝杆菌引起的,所以,牛结核的存在严重威胁着人类的健康。本病的传播流行直接影响着畜收业的发展,而且还会通过各种途径传染给人。因此,采取必要措施防治结核病已是势在必行。自上世纪90年代以来,人结核病呈世界范围性的回升,每年死亡人数达300万,属各类传染病死亡人数之首,创近年来历史最高记录。专家们估计,至2005年,结核病死亡人数将超过500万。我国现有结核病人600万,是世界上22个结核病高负担的国家之一,加之人口的流动,结核多重耐药菌株（MDR）的出现,与艾滋病的合并感染,以及多种社会经济因素造成了诊断和治疗上的巨大困难,严重影响到结核病的控制。因此,结核病成为人们关注的公共健康问题。为了纪念Kock1882年3月24日发现结核杆菌,世界卫生组织决定从1996年起将每年的3月24日定为结核病防制日,以警钟长鸣。WHO指出:“在存在牛结核的国家中,人类始终受到它的威胁,除非着手消灭牛结核病,否则,人类结核病的控制是不会成功的”。目前,一些较发达的国家和地区,如美国、澳大利亚、北欧等已基本消灭了牛结核病,但由于人结核病和野生动物结核病的存在,致使这些国家仍对牛结核处于不断的检疫和高度的警惕之中。在广大的发展中国家,该病仍严重的流行。但是,近年来,随着分子生物学和免疫学的发展和应用,对牛分枝杆菌的基因序列及其主要功能以及发病机理和免疫机制等都有了新的认识和了解,这些均将有利于结核病的防治。近年来,牛结核病的诊断方法逐渐得到完善,并且找到了很多结核分支杆菌的特异性抗原及其基因。将传统细菌检验方法免疫学方法和分子生物学的方法相结合,加速了对牛结核病的诊断的研究。特别是分子生物学技术的发展,对于阐明牛分支杆菌和结核分支杆菌的遗传变异规律及分子进化等方面都有重要的流行病学意义。细菌的外膜蛋白为一组位于菌体表面的蛋白,具有潜在的免疫原性和保护性抗原的作用。本试验以牛结核分支杆菌基因组为模板,扩增外膜蛋白OMP37和OMP12基因全长,获得1008bp和330bp大小的基因片段。将这两段片段直接克隆于原核表达载体PGEX-4T-2,成功构建阳性重组表达载体。IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE和Western-blotting检测,结果在大肠杆菌中成功表达出63KDa的外膜蛋白OMP37和38KDa的外膜蛋白OMP12,并且这两种蛋白都能与牛结核分支杆菌病临床阳性动物血清产生特异性结合反应,具有良好的免疫活性。表达的外膜蛋白能否作为牛结核分支杆菌快速ELISA检测方法的诊断抗原、能否用于基因工程疫苗将是我们下一步研究的重点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 病原及流行病学
• 1.1 病原
• 1.2 流行病学
• 1.2.1 发达国家的流行状况
• 1.2.2 发展中国家的流行状况
• 1.2.3 我国的流行状况
• 2 分支杆菌的基因分型研究
• 3 致病机理研究
• 3.1 分枝杆菌的化学结构
• 3.2 结核分枝杆菌逃避巨噬细胞吞噬的机理
• 3.2.1 受体等介导的病原体内吞作用
• 3.2.2 阻止吞噬溶酶体的形成
• 3.2.3 抵抗 R0I 和 RNI 的杀伤作用
• 3.3 结核分枝杆菌的基因有助于持续感染
• 3.4 结核分枝杆菌与细胞凋亡
• 4 免疫机理研究
• 5 牛结核病的诊断
• 5.1 ELISA 检测法
• 5.2 胶体金诊断法
• 5.3 IFN-γ诊断法
• 5.4 聚合酶链反应
• 5.5 核酸探针检测法
• 6 防制
• 7 结核杆菌核酸疫苗研究进展
• 7.1 核酸疫苗简介
• 7.2 核酸疫苗的特点
• 7.3 核酸疫苗研究进展
• 8 实验目的及意义
• 试验一、牛结核分枝杆菌OMP37、OMP12 基因的克隆与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 仪器与试剂
• 1.1.2 细菌与载体
• 1.1.3 培养基的配制
• 1.1.3.1 改良罗氏培养基的制备
• 1.1.3.2 LB培养基的制备
• 1.1.4 溶液的配制
• 1.1.5 PCR 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 模板DNA的提取
• 1.2.2 PCR 扩增
• 1.2.3 PCR 产物的克隆和序列分析
• 1.2.3.1 PCR 产物的回收与纯化
• 1.2.3.2 PCR 产物的连接
• 1.2.3.3 大肠杆菌 BL21 感受态细胞的制备
• 1.2.3.4 连接产物的转化
• 1.2.3.5 质粒 DNA 的提取
• 1.2.3.6 质粒DNA 的PCR 鉴定
• 1.2.3.7 阳性质粒的酶切鉴定
• 1.2.3.8 重组质粒的序列测定及分析
• 2. 结果
• 2.1 牛结核分枝杆菌的培养
• 2.2 牛结核分枝杆菌 OMP37、12 基因 PCR 扩增
• 2.3 重组载体的鉴定
• 2.3.1 重组质粒的PCR鉴定
• 2.3.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.4 序列测定结果
• 3 讨论
• 试验二 牛结核分支杆菌OMP37、OMP12基因的表达及免疫活性检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 仪器与试剂
• 1.1.2 菌株和质粒
• 1.1.3 主要溶液的配制
• 1.1.3.1 SDS-PAGE 试剂
• 1.1.3.2 Western-blot印迹试剂
• 1.1.4 引物设计
• 1.2 方法
• 1.2.1 重组表达载体的构建
• 1.2.1.1 牛结核分枝杆菌OMP37、OMP12基因的PCR扩增
• 1.2.1.2 PCR产物纯化回收
• 1.2.1.3 载体pGEX-4T-2 的制备
• 1.2.1.4 PCR 产物和载体pGEX-4T-2 的酶切
• 1.2.1.5 载体和目的基因片段的回收纯化
• 1.2.1.6 载体与目的基因片段的连接
• 1.2.1.7 BL21 感受态细胞的制备
• 1.2.1.8 连接产物转化感受态细胞
• 1.2.2 重组质粒的鉴定
• 1.2.2.1 质粒DNA 的提取
• 1.2.2.2 质粒DNA 的PCR 鉴定
• 1.2.2.3 质粒 DNA 的酶切鉴定
• 1.2.2.4 重组质粒的序列测定
• 1.2.3 重组阳性克隆的原核表达
• 1.2.3.1 重组阳性克隆的诱导表达
• 1.2.3.2 SDS-PAGE 样品的制备
• 1.2.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 1.2.3.4 表达蛋白的免疫原性检测
• 2 结果
• 2.1 OMP37、OMP12 PCR 扩增结果
• 2.2 原核表达重组质粒的构建及测序
• 2.3 OMP37、OMP12 基因片段在大肠杆菌中的表达
• 2.4 Western-blotting 分析
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文