嗜水气单胞菌外膜蛋白微球口服疫苗制备及动物免疫效果评价

论文摘要

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种水体环境中广泛分布的重要病原菌,可引发鱼类、两栖类动物的致死性疾病,给淡水养殖业生产带来严重的经济损失。该菌也可通过水产动物感染人畜,威胁人畜健康。因此,在水产养殖中,对嗜水气单胞菌感染的防控具有重要意义。口服疫苗用于动物免疫,优点突出,动物应激小,易于大规模免疫。口服接种疫苗较之传统接种方式还存在一些潜在优势,它提高了疫苗的稳定性和安全性,延长了疫苗的保存期限,具有良好的应用前景。本文使用实验室已构建的嗜水气单胞菌外膜蛋白重组菌,优化外膜蛋白表达条件。研究发现,在LB培养基中,37℃培养重组菌至OD值0.8,以1.0mmol/L的IPTG在28℃诱导工程菌4.5-5h,外膜蛋白表达量最高。在此条件下大量制备该蛋白,以蛋白为芯材,以生物相容性良好的海藻酸钠为壁材,最外层包覆壳聚糖,制备微球口服疫苗。通过改进微球化方法,结合喷雾、二价离子溶液收集成型（液相-凝胶转化）、高速匀浆包裹、保护剂冷冻干燥等方法优化制备工艺。通过四因素三水平正交试验,确定了CaCl2浓度0.5%、搅拌速度1200rpm、进料速度15mL/min、海藻酸钠浓度2.0%等微球制备条件。所得微球包封率83.07%,pH7.4 PBS膨胀率559.36%,8.5%NaCl膨胀率605.89%,蒸馏水膨胀率652.01%,载蛋白量0.5786mg/10mg,酸碱条件释放能力符合试验需要,饲喂安全性良好,贮存稳定性良好。以该工艺制备的微球具备预期理化性质,实现了所需微球口服疫苗的优化制备。为评价嗜水气单胞菌外膜蛋白亚单位微球口服疫苗（OMP-MS）的免疫效果,本研究以优化的条件制备口服疫苗,采用不同剂量注射或灌胃免疫小鼠,利用荧光定量PCR （RT-PCR）、酶联免疫吸附法检测（ELISA）、组织石蜡切片制备等方法,分析血清抗体、肠黏膜抗体、回肠集合淋巴小结等的变化,并借助免疫保护试验评价免疫效果。结果表明,各口服免疫组（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）肠黏膜sIgA水平显著高于对照组（Ⅵ、Ⅶ组）和注射免疫组（Ⅰ组）（P<0.05）,提示口服免疫诱导了局部的特异性免疫,而血清IgG水平低于注射免疫组,但仍高于对照组；荧光定量PCR分析,口服免疫组和注射免疫组细胞因子IFN-γ和IL-4 mRNA表达在免疫后上调；口服免疫组回肠集合淋巴小结数目增多,体积增大,这些都提示疫苗刺激并增强了机体免疫反应；免疫保护试验显示,灭活菌注射组和微球口服组,低、中、高剂量外膜蛋白微球口服组分别获得了50.00%（4/8）、50.00%（3/6）、33.33%（3/9）、75%（6/8）和33.33%（3/9）的相对保护率,说明中剂量外膜蛋白微球口服免疫小鼠,可获得较好的免疫保护效果。在池塘网箱养殖条件下驯化鳊鱼,分别用嗜水气单胞菌全菌疫苗和外膜蛋白疫苗进行注射和口服免疫。免疫后每周取血清、后肠肠段,检测血清/黏液抗体、血清溶菌酶（LSZ）活性、血清SOD活性,并检测头肾细胞吞噬活性,在第45天进行免疫保护试验。结果显示：免疫后期,口服免疫组（Ⅲ、Ⅳ组）血清/后肠黏液IgM抗体水平显著高于注射免疫组（Ⅰ、Ⅱ组）（P<0.05）,灭活菌微球口服免疫组（Ⅲ组）与外膜蛋白微球口服免疫组（Ⅳ组）差异不显著（P>0.05）；43d口服免疫组体表黏液IgM抗体检出率高于注射免疫组。各免疫组血清溶菌酶（LSZ）活性、SOD活性在免疫期内波动上升,免疫后期显著升高。45d进行的免疫保护试验显示,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别获得了50.00%（16/30）、55.67%（17/30）、25.00%（9/30）、21.43%（8/30）的相对保护率。说明,制备的嗜水气单胞菌外膜蛋白口服疫苗免疫鳊鱼具备一定的免疫保护作用,但免疫效果低于注射免疫。综上所述,优化制备的嗜水气单胞菌外膜蛋白口服疫苗免疫小鼠、鳊鱼,免疫效果分析证实疫苗诱导了试验动物的免疫应答,产生了一定的免疫保护效果。研究为基因工程亚单位口服疫苗用于淡水养殖业的疾病预防提供了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 淡水养殖鱼类嗜水气单胞菌疫苗研究进展
• 1 传统疫苗
• 1.1 全菌灭活疫苗
• 1.2 单位疫苗
• 2 生物被膜疫苗
• 3 基因工程疫苗
• 3.1 基因工程亚单位苗
• 3.2 基因缺失苗
• 3.3 DNA疫苗
• 4 佐剂疫苗
• 4.1 脂质体佐剂疫苗
• 4.2 免疫刺激复合体佐剂疫苗
• 4.3 基于多聚物佐剂的疫苗
• 4.4 乳化佐剂疫苗
• 5 展望
• 参考文献
• 第二章 淡水养殖鱼类口服免疫的研究进展
• 1 口服免疫的应用
• 2 影响鱼类口服免疫效果的因素
• 3 口服疫苗佐剂
• 3.1 海藻酸钠
• 3.2 聚交酯醣酯聚合物
• 3.3 壳聚糖及其衍生物
• 3.4 其他辅料
• 4 展望
• 参考文献
• 下篇 试验研究
• 第三章 嗜水气单胞菌外膜蛋白在大肠杆菌中高效表达的条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 不同培养基对蛋白表达量的影响
• 1.2.2 IPTG诱导条件对对蛋白表达量的影响
• 1.2.3 SDS-PAGE蛋白浓度分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同培养基对外膜蛋白表达量的影响
• 2.2 IPTG对外膜蛋白表达量的影响
• 2.2.1 IPTG诱导时间对蛋白表达量的影响
• 2.2.2 IPTG工作浓度对蛋白表达量的影响
• 2.2.3 诱导温度对蛋白表达量的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 嗜水气单胞菌外膜蛋白亚单位口服疫苗制备工艺优化与性能评价
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 微球口服疫苗制备方法
• 1.3 微球口服疫苗制备优化与微球性质分析
• 1.3.1 微球口服疫苗制备优化
• 1.3.2 膨胀率
• 1.3.3 包封率
• 1.3.4 载蛋白量
• 1.3.5 抗原完整性与免疫反应性
• 1.3.6 酸碱条件下释放试验
• 1.3.7 安全性试验
• 1.3.8 贮存试验
• 2 结果与分析
• 2.1 微球形态
• 2.2 粒径分析
• 2.3 抗原完整性与免疫反应性
• 2.4 包封率
• 2.5 载蛋白量
• 2.6 酸碱条件蛋白释放试验
• 2.7 膨胀率
• 2.8 安全性试验
• 2.9 贮存稳定性试验
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 嗜水气单胞菌外膜蛋白微球疫苗的小鼠口服免疫试验
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 实验动物
• 1.3 免疫程序
• 1.4 免疫方法
• 1.4.1 皮下注射免疫
• 1.4.2 灌胃免疫
• 1.5 样品采集
• 1.5.1 回肠肠段取样与收集肠腔内容物洗液
• 1.5.2 清
• 1.5.3 脾脏淋巴细胞
• 1.6 样品检测
• 1.6.1 酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清特异性IgG和IgA、肠sIgA水平
• 1.6.2 脾脏淋巴细胞细胞因子mRNA表达水平
• 1.6.3 回肠肠段石蜡切片制备
• 1.6.4 免疫保护试验
• 1.6.5 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 肠内容物IgA水平的ELISA检测
• 2.2 血清IgA水平的ELISA检测
• 2.3 血清IgG水平的ELISA检测
• 2.4 脾脏淋巴细胞细胞因子mRNA表达水平检测
• 2.5 回肠淋巴相关组织的观察
• 2.6 免疫保护试验
• 2.6.1 LD50测定
• 2.6.2 攻毒免疫保护试验
• 3 讨论
• 参考文献
• 第六章 嗜水气单胞菌外膜蛋白微球疫苗的鳊鱼口服免疫试验
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验动物
• 1.3 口服免疫用饲料制备
• 1.4 免疫程序
• 1.5 样品采集
• 1.5.1 清
• 1.5.2 头肾细胞分离
• 1.5.3 体表黏液
• 1.5.4 后肠黏液
• 1.6 实验室检测项目
• 1.6.1 细胞吞噬活性检测
• 1.6.2 血清、后肠黏液、体表黏液IgM抗体检测
• 1.6.3 血清超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
• 1.6.4 清溶菌酶活性的测定
• 1.6.5 数据的统计分析
• 1.6.7 半数致死量（LD50）测定
• 1.6.8 免疫保护率的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 头肾细胞吞噬活性的检测
• 2.1.1 流式细胞仪分析
• 2.1.2 平板计数结果
• 2.2 IgM的ELISA检测
• 2.2.1 血清
• 2.2.2 体表黏液
• 2.2.3 后肠黏液
• 2.3 血清超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
• 2.4 血清溶菌酶（LSZ）活性的测定
• 2.5 免疫保护率的测定
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 全文总结
• 致谢