β-磷酸三钙对成骨细胞基因表达的影响及骨粘连蛋白的纯化

论文摘要

钙磷可降解生物医用材料在医学领域上有着重要的研究和应用前景，尤其在骨修复、骨替代、药物释放载体等医学领域都有着重要的应用。因此，探讨Ca、P生物陶瓷材料在体内参与有生命组织过程的机制成为近年来研究者所关注的重点。本文主要从生物学和分子生物学的角度来探讨钙磷降解材料参与构建有生命组织的机制，开展钙磷降解材料生物矿化的生物学。在本实验中，分别用组织块法和酶消化方法从Wister新生乳鼠的颅骨中分离了成骨细胞，并对所获得的细胞用差速贴壁方法进行纯化，并进行碱性磷酸酶染色和钙结节染色，染色后的结果证明两种方法所获得的成骨细胞具有良好的生物学特性。在对同一批组织块进行连续培养时，发现将同一批组织块法进行连续培养后均可获得细胞形态良好的成骨细胞，碱性磷酸酶染色显示有高的碱性磷酸酶活性。证明连续组织法培养的成骨细胞生物学特性良好，确保了实验的一致性，而为后面的进一步的深入研究提供大量的种子细胞。将成骨细胞和钙磷降解材料混合培养后，显微镜下观察可以发现成骨细胞对β-TCP颗粒有明显的吞噬作用。同时MTT实验分析表明，β-TCP有利于成骨细胞的生长和增殖。将成骨细胞和β-TCP颗粒混合培养一段时间以后，提取成骨细胞的总RNA，运用RT-PCR、PCR手段来检测钙磷材料对成骨细胞相关基因表达水平的影响。合成并设计成骨细胞相关基因的引物，RT-PCR、PCR方法检测结果显示，β-TCP颗粒可以显著促进成骨细胞中与成骨作用相关的基因，如碱性磷酸酶（ALP）mRNA、骨粘连蛋白（ONN）mRNA的表达。由于β-TCP能促进成骨细胞骨粘连蛋白mRNA表达。因此，为了探讨骨相关蛋白在矿化过程中的作用，将大鼠骨粘连蛋白基因重组到原核表达载体pET28a中，构建了可以表达ONN的pHX201／ONN表达载体。同时将本中心已经构建的大鼠骨粘蛋白表达载体pGEX-KG2／ON，以及新构建的pHX201／ONN表达载体分别插入到大肠杆菌E．coli BL21（DE3）pLyS和R1L菌中进行诱导表达，结果发现pGEX-KG2／ON表达载体比pHX201表达载体更有利于骨粘蛋白的表达。并进一步对pGEX-KG2／ON表达载体的表达和纯化条件进行优化，将含有pGEX-KG2／ON表达载体的细菌进行扩增，并将增菌后的菌液通过离心、细菌破碎、硫酸铵分级沉淀、超滤管分离、GST亲和层析柱层析逐步纯化，获得了纯度较高GST融合蛋白。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 生物骨的组成
• 1.2 钙磷降解材料研究的意义
• 1.3 钙磷降解材料降解机理及细胞的作用
• 1.4 成骨细胞在骨构建和修复中的作用
• 1.5 成骨细胞非胶原蛋白在骨修复和构建中的作用
• 1.6 生命大分子在生物矿化中的作用
• 1.7 论文设计思路和路线
• 第2章 成骨细胞的分离、培养及纯化
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 仪器与试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 成骨细胞的分离和原代培养
• 2.2.2 成骨细胞的纯化和传代
• 2.2.3 植块法分离、培养和纯化成骨细胞
• 2.2.4 连续植块法分离成骨细胞
• 2.2.5 成骨细胞生物学特性分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 形态学观察
• 2.3.2 成骨细胞生长曲线
• 2.3.3 化学染色
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第3章 成骨细胞与材料的相互作用
• 3.1 仪器和试剂
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 成骨细胞和钙磷材料的体外培养
• 3.2.2 成骨细胞和材料作用后的MTT测试
• 3.2.3 与材料作用后成骨细胞的镜下观察
• 3.2.4 材料作用后的成骨细胞中基因体外扩增
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 体外培养后形态学观察
• 3.3.2 成骨细胞MTT分析
• 3.3.3 材料作用后成骨细胞相关基因RT-PCR分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 β-TCP和成骨细胞的相互作用
• 3.4.2 β-TCP对成骨细胞相关基因mRNA表达水平的影响
• 3.4.3 影响总RNA提取的因素
• 3.5 小结
• 第4章 大鼠骨粘连蛋白的体外诱导、表达及纯化
• 4.1 实验器材与试剂
• 4.1.1 实验器材
• 4.1.2 试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 大鼠骨粘连蛋白表达质粒pHX201/ON的构建与鉴定
• 4.2.2 重组蛋白的诱导和表达
• 4.2.3 重组蛋白条件优化
• 4.2.4 蛋白质的提取和纯化
• 4.2.5 蛋白染色，脱色条件的优化
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 pHX201/ON表达载体的构建与鉴定
• 4.3.2 细菌IPTG诱导生长曲线绘制
• 4.3.3 诱导条件的优化
• 4.3.4 蛋白的提取和纯化
• 4.3.5 染色和脱色条件优化
• 4.4 讨论
• 第5章 结论与展望
• 参考文献
• 附录 攻读硕土期间发表的论文
• 致谢