微生物酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究

论文摘要

D-对羟基苯甘氨酸（D-p-hydroxyphenylglycine,D-HPG）是临床上广泛使用的半合成β-内酰胺类抗生素的重要结构部分。在工业生产上可利用 D,L-对羟基苯乙内酰脲（D,L-p-hydroxy-phenylhydantoin,D,L-HPH）为原料经 D-乙内酰脲酶（D-hy-dantoinase,Dhase,EC 3.5.2.2）和D-脱氨甲酰基水解酶（D-decarbamoylase,Dcase,EC3.5.1.6） 水解而获得。对一株能转化 D,L-对羟基苯乙内酰脲为 D-对羟基苯甘氨酸的菌株 MMR003 进行了细菌分类学鉴定,该菌为皮氏伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pickettii）。实验通过 Southern 杂交,部分文库构建和筛选,并经一系列亚克隆测序分析,获得一长度为 1374bp 的完整开放阅读框,编码 458 个氨基酸的D-乙内酰脲酶基因。用该基因序列构建的高表达质粒 pXZPH2 转化 E.coli BL21 （DE3）,经IPTG 诱导后,检测到 D-乙内酰脲酶活性。该基因编码的氨基酸序列经 Blast 同源比较分析与放射形土壤杆菌 NRRL B11291 所产相应酶有 85%的同源性。以 D,L-对羟基苯乙内酰脲为底物测得的表达酶的活力 0.66U/ml,比出发菌株 MMR003 提高了 2 倍。 D 型氨基酸是半合成青霉素和头孢菌素的重要中间体,目前主要是由相应的乙内酰脲经含有两个酶-D-乙内酰脲酶、N-脱氨甲酰基酶的微生物转化获得。这两个酶首先把乙内酰脲转化为 N-氨基甲酰-对羟基苯甘氨酸（N-carbamyl-D-p-hydroxyphenylglycine,CpHPG）,然后再转化相应的 D 型氨基酸。我们试着寻找更快更有效的转化菌株,把来源于皮氏伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pickettii）的表达该两种酶的两个基因同时克隆到大肠杆菌中,获得共表达两种酶的基因工程菌株,两个基因的顺序是 Dcase 基因在 Dhase 基因的前面,同一个启动子。重组的菌株能够稳定的表达两种酶,并且能够有效的转化乙内酰脲到相应的 D 型氨基酸。并且这种Dcase基因在Dhase基因之前的构建方式在22℃时培养比在37℃能够获得更高的生物量和酶活。该基因重组菌同样的生物量和酶活比现有的生产菌株皮氏伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pickettii）转化底物的效率提高两倍以上。并且发现这样的转化效率和第二个酶的表达水平有直接关系,表明在现有的工业生产条件下第二个酶的浓度是整个转化过程中的限制因素。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 D-对羟基苯甘氨酸的性质特征
• 2 D-对羟基苯甘氨酸的合成
• 2.1 对羟基扁桃酸法
• 2.2 乙醛酸法
• 2.3 生物酶法
• 3 微生物酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究进展
• 3.1 单酶法
• 3.2 双酶法
• 3.3 一菌多酶法
• 3.4 生物酶的获得――菌株的选育
• 4 D-对羟基苯甘氨酸市场情况
• 参考文献
• 第二章 D-乙内酰脲酶基因（dha）的克隆、测序及表达
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 试剂和工具酶
• 2.1.3 培养基及培养条件
• 2.2 方法
• 2.2.1 细菌学鉴定方法
• 2.2.2 分子生物学方法
• 2.2.3 酶活测定方法
• 3 实验结果
• 3.1 MMR003 菌株的细菌学分类鉴定
• 3.2 MMR003D-乙内酰脲酶基因的克隆
• 3.2.1 基因杂交探针的选择
• 3.2.2 MMR003 中目标基因片断的克隆
• 3.2.3 MMR003D-乙内酰脲酶的DNA 序列
• 3.3 MMR003D-乙内酰脲酶基因在大肠杆菌中的表达
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 D-乙内酰脲酶（dha）和N-脱氨甲基酶（dca）在大肠杆菌中的共表达
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 试剂和工具酶
• 2.1.3 培养基和培养条件
• 2.2 方法
• 2.2.1 分子生物学方法
• 2.2.2 菌种构建
• 2.2.3 酶活测定方法
• 3 实验结果
• 3.1 摇瓶发酵培养基的选择及最适发酵条件
• 3.2 连续转化实验验证共表达的活力
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四章 基因工程大肠杆菌MMFY01 中试实验
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 试剂和仪器
• 2.1.3 培养基及培养条件
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌浓测定方法
• 2.2.2 酶活测定方法
• 2.2.3 工程菌MMFY01 种子液的制备方法
• 2.2.4 野生型假单孢菌、基因工程假单孢菌种子液制备方法
• 3 实验结果
• 3.1 基因工程菌MMFY01 发酵结果
• 3.2 野生型假单孢菌和基因重组假单孢菌发酵结果
• 3.3 工业替代培养基摇瓶实验结果
• 3.4 转化实验结果
• 3.4.1 10L转化罐转化实验
• 3.4.2 摇瓶转化实验
• 4 讨论
• 参考文献
• 第五章 结论
• 附注
• 版权声明
• 致谢