光合细菌Rhodobacter sphaeroides新型异源蛋白表达体系的构建及其应用研究

论文摘要

大肠杆菌和酵母是目前最常用的表达系统,广泛用于生产具有重要生物学功能的重组蛋白。但是,利用当前商业化的表达系统生产重组蛋白时,都不能在提取前快速、实时地检测其表达水平。类球红光合细菌Rhodobacter sphaeroides全基因组测序已经完成,是研究细菌光合作用和膜蛋白形成的模式生物。在合适的生长条件下,Rb. sphaeroides细胞质膜（CM）会自动内嵌形成胞质内膜系统（ICM）,同时捕光色素蛋白复合体2（LH2）和LH1以及光化学反应中心（RC）得到大量表达,它们的含量可超过总膜蛋白的50%。其中,LH2由9对α-亚基和β-亚基组成,分别由puc1BAC操纵子的puc1A和puc1B编码。研究发现,该细菌中还有第二个puc操纵子puc2BA,也参与LH2的合成。LH2在800 nm和850 nm处有最大特征光谱吸收,LH2的表达量越高,特征光谱吸收峰值越大。因此,当异源蛋白和LH2的α-亚基或β-亚基组成融合蛋白后,便可以在提取前通过分析寄主细菌培养液在800 nm和850 nm处的光谱吸收而快速实时地检测重组蛋白的表达水平。本研究以Rb. sphaeroides DD13突变株（基因组缺失puc1BA和pufBALMX,缺少LH1、LH2和RC）为出发菌株,通过同源重组技术,敲除第二个puc操纵子puc2BA获得了突变体Rb. sphaeroides CQU68 （基因组缺失puc1BA和pufBALMX,puc2BA）;利用大肠杆菌乳糖操纵子基因lacIq和lacO及Rb. sphaeroides puc1BAC操纵子的启动子pucP构建了杂合启动子lacIq-pucP-lacO,并运用该启动子及LH2β-亚基和α-亚基构建了适合于Rb. sphaeroides表达异源融合蛋白的表达载体pRKlacIqpucPpuc1BHis101AC;通过His-tag标签建立了亲和层析一步法快速纯化LH2及LH2β-亚基融合蛋白的方法体系。利用CQU68突变体及上述表达载体表达了LH2β-亚基-GFP和LH2β-亚基-HNP3融合蛋白。光谱吸收分析、SDS-PAGE和Western blotting结果表明,LH2β-亚基融合蛋白在800 nm和850 nm处的特征光谱吸收可以作为快速实时检测融合蛋白表达水平的指标。本文取得的主要结论如下:1、杂合启动子lacIq-pucP-lacO的构建实现了LH2和LH2β-亚基融合蛋白表达的人为控制,它们的表达受氧气浓度和IPTG的严格调控。只有在较低的氧气浓度（半好氧）并添加IPTG诱导的情况下,LH2及LH2β-亚基融合蛋白才能表达;IPTG最佳使用浓度为1 mM。2、利用His-tag标签通过亲和层析实现了LH2及LH2β-亚基融合蛋白的一步法快速纯化。纯化的LH2及LH2β-亚基融合蛋白仍结合着大量的细菌叶绿素和类胡萝卜素,具有良好的电子传递活性。与传统的蔗糖密度梯度离心法相比,该方法体系大大简化了LH2和LH2β-亚基融合蛋白的纯化过程。3、利用Rb. sphaeroides CQU68突变体成功表达了LH2β-亚基-GFP和LH2β-亚基-HNP3融合蛋白。融合蛋白表达后能够伴随着标签蛋白LH2β-亚基进入ICM,在800 nm和850 nm处有LH2特异的光谱吸收。光谱吸收、SDS-PAGE和Western blotting结果表明细菌培养液在800 nm和850 nm处的特征光谱吸收峰值越高,则LH2β-亚基融合蛋白的表达量越大。因此,在LH2β-亚基融合蛋白工程菌株培养过程中,可以利用其培养液在800 nm和850 nm处的特征光谱吸收峰实时快速地检测融合蛋白表达的水平。本文利用光合细菌Rb. sphaeroides构建了一种全新的、可严格调控并能快速实时检测重组蛋白表达水平的体系,在异源蛋白表达及功能研究领域,具有广阔的应用前景。

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英文摘要

缩略词表

1 绪论

1.1 问题的提出及研究的意义

1.1.1 问题的提出

1.1.2 研究的意义

1.2 国内外研究现状

1.2.1 蛋白质表达系统研究进展

1.2.2 光合细菌应用研究现状

1.2.3 光合细菌捕光系统概述

1.2.4 光合作用基因的表达调控

1.3 本文研究的目的和研究内容

1.3.1 本文研究的目的

1.3.2 本文的研究内容

2 带有杂合启动子的 LH2 α/β-亚基表达载体的构建

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.3.1 表达载体的构建

2.3.2 LH2 的诱导表达和IPTG 最佳诱导浓度的确定

2.3.3 LH2 的提取和鉴定

2.4 讨论

2.5 本章小结

3 一步法快速纯化 LH2

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 表达载体的构建

3.3.2 LH2 的诱导表达

3.3.3 LH2 的纯化

3.3.4 LH2 的SDS-PAGE 和Western blotting 分析

3.3.5 LH2 的tritox-X100 处理分析

3.3.6 LH2 的能量传递分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

4 puc1BA 和puc2BA 基因缺失突变体的构建

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.3.1 pSUP202Δpuc2BA 自杀载体的构建

4.3.2 puc1BA 和puc2BA 基因缺失突变体CQU68 的构建

qpucPpuc1BGFPHis₁₀1AC 的构建'>4.3.3 融合蛋白表达载体pRKlacI^qpucPpuc1BGFPHis₁₀1AC 的构建

qpucPpuc1BHNP3His₁₀1AC 的构建'>4.3.4 融合蛋白表达载体pRKlacI^qpucPpuc1BHNP3His₁₀1AC 的构建

4.3.5 LH2 β-亚基融合蛋白在CQU68 中的表达分析

4.4 讨论

4.5 本章小结

5 光合细菌 Rb.sphaeroides 新型异源蛋白表达体系的构建

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.3.1 LH2 β-亚基融合蛋白在CQU68 中的表达分析

5.3.2 异源蛋白表达水平的快速实时检测

5.3.3 LH2 光谱吸收降低的原因分析

5.3.4 LH2 光谱吸收偏移的原因分析

5.4 讨论

5.5 本章小结

6 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 本文的创新之处

6.3 展望

致谢

参考文献

附录

A 作者在攻读博士学位期间发表的论文和申请的专利目录

B 作者在攻读博士学位期间主持的科研项目

C 作者在攻读博士学位期间参加的科研项目

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