草地早熟禾（Poa pratensis L.）抗旱耐盐基因遗传转化

论文摘要

本研究通过对草地早熟禾（Poa pratensis L.）植株再生体系的优化,建立了适合于三个品种的高频再生体系。在此基础上,通过基因枪轰击法把与抗旱、耐盐有关的外源基因（DREB1A、BADH-CMO、CMO）对草地早熟禾胚性愈伤组织进行遗传转化,经过潮霉素筛选、PCR扩增与Southern杂交检测,获得了转基因植株。同时,对部分转基因植株进行了干旱、盐碱胁迫处理,检测了转基因植株在抗旱、耐盐特性上的实际效果。通过研究,获得了以下结果:1.通过对不同外植体诱导效果,接种方式,培养条件等因素的研究,确定了以下的愈伤组织诱导条件:以成熟种子为外植体,消毒处理后,直接接种于愈伤组织诱导培养基中黑暗培养。培养基的碳源是30mg/L蔗糖。选择致密、易碎、生长迅速的愈伤组织继代能够保持草地早熟禾的胚性,可以为遗传转化提供长期良好的植物材料。2.通过单因素与正交试验设计,获得了适合于‘Baron’（简称B）、‘Mardona’（简称M）、‘Midnight’（简称Md）品种的完整高频再生体系。P2:MS+2,4-D（1mg/L）+6-BA（0.1mg/L）+ CuSO4（3mg/L）+CH（1g/L）为B品种的愈伤组织诱导培养基,P5:MS+2,4-D（2mg/L）+6-BA（0mg/L）+CuSO4（3mg/L）+CH（1g/L）为Md品种的愈伤组织诱导培养基,KM:MS+2,4-D（2mg/L）+6-BA（0.2mg/L）+ CuSO4（3mg/L）+CH（1g/L）为M品种的愈伤组织诱导培养基,三个品种最高胚性愈伤组织诱导率分别为38.19%、28.66%和31.67%;AK2:MS+KT（0.2mg/L）+6-BA（1mg/L）为B品种愈伤组织分化培养基,AL2:MS+6-BA（1mg/L）+LH（0.5g/L）为Md品种愈伤组织分化培养基,KBN:MS+KT（0.2mg/L）+ 6-BA（1mg/L）+NAA（0.5mg/L）为M品种愈伤组织分化培养基,三个品种最高愈伤组织分化率分别为53.33%、53.67%和60.00%。3.在已经建立的高效再生系统基础上,通过研究不同的基因枪轰击参数,得到适合于草地早熟禾基因枪轰击的条件:采用Ca（NO3）2+PEG4000包被质粒DNA;使用1μm金粉作为质粒DNA的载体;轰击高度为6cm、轰击次数为1次、无渗透处理进行轰击效果较好。采用潮霉素（Hy）为草地早熟禾转基因植株抗生素筛选标记,Md品种愈伤组织继代的筛选浓度为130mg/L,B品种愈伤组织继代的筛选浓度为100mg/L。4.通过采用基因枪转化法将DREB1A、BADH-CMO、CMO基因导入草地早熟禾胚性愈伤组织中,并且获得了再生植株。通过PCR、Southern分子检测,证明在B品种中获得转DREB1A基因株系13个,转双基因株系23个,转CMO基因株系6个。在Md品种中获得了转DREB1A基因株系1个,转双基因株系1个。在M品种中获得了转双基因株系2个,转CMO基因株系2个。5.通过对部分转基因植株进行干旱、盐碱胁迫处理,对质膜透性、MDA含量、SOD

论文目录

• 独创性声明
• 关于论文使用授权的说明
• 摘要
• Abstract
• 缩写词
• 第一章 综述
• 1.1 草地早熟禾再生体系研究进展
• 1.1.1 外植体选择
• 1.1.2 培养条件
• 1.1.3 不同基因型对再生率的影响
• 1.1.4 常见植物生长调节剂对再生体系的影响
• 1.1.4.1 生长素类
• 1.1.4.2 细胞分裂素类
• 1.1.4.3 脱落酸
• 1.2 草坪草遗传转化研究进展
• 1.2.1 常见的遗传转化方法
• 1.2.1.1 农杆菌转化法
• 1.2.1.2 基因枪转化法
• 1.2.1.3 电击法
• 1.2.1.4 PEG 介导转化法
• 1.2.2 草地早熟禾遗传转化概述
• 1.3 植物常见抗旱、耐盐基因概述
• 1.3.1 干旱、盐碱等逆境与植物的生理调控
• 1.3.1.1 逆境对植株生理代谢过程影响
• 1.3.1.2 植物响应逆境的生理机制
• 1.3.2 部分已分离和鉴定的抗逆基因作用机理
• 1.3.2.1 渗透调节因子合成酶基因及其应用
• 1.3.2.2 功能蛋白基因及其应用
• 1.4 本研究使用的抗旱、耐盐基因
• 1.4.1 DRE81A 转录因子
• 1.4.2 甜菜碱合成酶基因
• 1.5 本研究的意义、内容与技术路线
• 1.5.1 研究背景、目的、意义
• 1.5.2 研究内容
• 1.5.3 研究的技术路线
• 第二章 草地早熟禾再生体系建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 外植体的获得
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 培养方法
• 2.1.5 再生植株的移栽
• 2.1.6 数据统计及分析方法
• 2.1.7 试验设计
• 2.1.7.1 不同因素对草地早熟禾愈伤组织诱导的影响
• 2.1.7.2 不同激素在草地早熟禾再生体系建立中的作用研究
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同因素对草地早熟禾愈伤组织诱导的影响
• 2.2.1.1 不同外植体诱导愈伤的影响
• 2.2.1.2 外植体消毒方式对诱导愈伤影响
• 2.2.1.3 光照与黑暗培养对愈伤组织诱导的影响
• 2.2.1.4 碳源对草地早熟禾愈伤组织诱导的影响
• 2.2.2 基因型对愈伤组织诱导的影响
• 2.2.3 不同激素对草地早熟禾再生体系影响
• 2.2.3.1 正交设计在愈伤组织诱导中的应用
• 2.2.3.2 正交设计结果验证
• 2.2.3.3 正交设计应用于M 品种
• 2.2.3.4 M 品种愈伤组织分化培养
• 2.2.3.5 单因素试验设计对B、Md 品种分化试验结果
• 2.2.4 最终确定的培养基
• 2.3 讨论
• 2.3.1 愈伤组织诱导条件
• 2.3.1.1 外植体的选择
• 2.3.1.2 基因型选择
• 2.3.1.3 最适愈伤组织诱导条件
• 2.3.2 正交设计在草地早熟禾再生体系中应用
• 第三章 草地早熟禾遗传转化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 受体材料
• 3.1.2 表达载体
• 3.1.3 转化方法
• 3.1.3.1 金粉 DNA 复合体的制备
• 3.1.3.2 受体材料的处理
• 3.1.3.3 受体材料的轰击
• 3.1.3.4 转化过程中的培养基
• 3.1.4 基因枪转化因素的确定
• 3.1.4.1 Gus 基因表达检测溶液的配制
• 3.1.4.2 染色方法
• 3.1.4.3 Gus 染色取样方法
• 3.1.5 转化植株的筛选再生
• 3.1.6 对转化植株进行田间管理
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 Gus 基因的表达检测
• 3.2.2 金粉包裹物质对基因枪转化的影响
• 3.2.3 金粉直径对基因枪转化的影响
• 3.2.4 轰击高度、次数、渗透处理对转化的影响
• 3.2.5 抗生素筛选压的确定
• 3.2.6 抗性植株的获得
• 3.3 讨论
• 3.3.1 基因枪轰击参数的选择
• 3.3.2 不同基因型建立基因枪转化体系的差异
• 3.3.3 转化植株分化过程中的形态变化
• 第四章 转化植株的分子检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 组织化学染色
• 4.1.3 抗性植株的分子检测
• 4.1.3.1 植物DNA 的提取
• 4.1.3.2 转化植株的PCR 扩增检测
• 4.1.3.3 转化植株的Southern 杂交检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 Gus 组织显色结果
• 4.2.2 抗性植株的分子检测
• 4.2.2.1 植物DNA 提取
• 4.2.2.2 转化植株的 PCR 扩增检测
• 4.2.2.3 转化植株的 Southern 杂交检测
• 4.2.3 总体检测结果
• 4.3 讨论
• 4.3.1 植物基因组DNA 的提取方法
• 4.3.2 PCR 扩增中常出现的问题
• 4.3.3 Southern 杂交需要注意的问题
• 第五章 转基因植株生理检测
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 测试指标与测试方法
• 5.1.2.1 细胞膜透性的测定
• 5.1.2.2 丙二醛（MDA）含量的测定
• 5.1.2.3 过氧化物酶（POD）活性的测定
• 5.1.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 转基因植株形态上的变化差异
• 5.2.2 植株抗旱性指标测定
• 5.2.2.1 细胞膜透性
• 5.2.2.2 丙二醛含量
• 5.2.2.3 POD 活性
• 5.2.2.4 SOD 活性
• 5.2.3 植株耐盐性指标测定
• 5.3 讨论
• 5.3.1 植株生理指标的测定
• 5.3.2 外源基因在植株中的表达
• 5.3.3 提高植株抗旱、耐盐性的途径
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附图 I
• 附图Ⅱ
• 附图Ⅲ
• 附图Ⅳ
• 附图Ⅴ
• 个人简介
• 导师简介
• 获得成果目录清单
• 致谢
• 博硕士学位论文同意发表声明