β-catenin siRNA对肝癌细胞系SMMC-7721和HepG-2增殖与凋亡的影响

论文摘要

原发性肝癌是世界上最常见的十种恶性肿瘤之一,其起病隐匿,发展迅速,恶性程度高,一旦发现多为中晚期,失去了手术机会。因此,长久以来肝癌的研究一直为基础和临床科研人员所关注。RNAi技术是1998年由Fire首次发现并命名的,是由双链RNA引发的转录后水平的基因静默机制,是美国《Science》和《Nature》评出的2002年度最重要的科技成果之一。目前已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究,有可能为肿瘤基因治疗提供新策略。研究发现Wnt基因与组织内环境稳定和肿瘤发生有关,Wnt信号转导的关键胞浆中存在的可溶性的β-catenin,它是Wnt信号的调节开关,以p-连环素（β-catenin）为中心的Wnt信号转导通路是当今生物医学研究领域中最前沿、最活跃的主题之一,被认定为肿瘤发生过程中关键的信号通路之一。β-catenin是胞质中的一种多功能蛋白,处于Wnnt信号通路的活化中心,并与形成肿瘤的其它因素密切相关。进一步研究这种关系,可以为我们更好的解释肿瘤的发生,并有助于肿瘤的预防与治疗。现有的研究已发现在肝癌中存在着细胞凋亡、细胞周期、端粒酶、信号传导通路、新生血管及细胞外基质等方面的异常,但β-catenin与这些方面的关系尚未被人们完全阐明。本实验研究的主要是沉默肝癌细胞中的β-catenin基因,揭示肝癌细胞中β-catenin对细胞凋亡、细胞周期、信号传导通路的影响,建立肝癌发病机制的部分网络结构,证实Wnt/β-catenin信号传导通路在肝癌发生、发展中的作用及siRNA在肝癌基因治疗方面的作用,为研究肝癌发病机制的网络结构提供理论依据,同时也为肝癌的治疗提供方法及理论依据。我们的实验应用RNA干涉技术设计构建了针对β-catenin mRNA的siRNA重组质粒,通过脂质体转染导入不同的肝癌细胞株SMMC-7721和HepG-2中,观察重组质粒在不同的肝癌细胞株对β-catenin表达的影响,进而观察β-catenin过度表达被拮抗后不同肝癌细胞株的增殖与凋亡发生的变化,以了解β-catenin在肝癌发生中的作用以及与肝癌细胞增殖与凋亡的关系,同时阐述不同肝癌细胞株对沉默β-catenin基因后在增殖与凋亡方面存在的差异。实验的RT-PCR、Western boltting的结果等证实上述质粒可在mRNA及蛋白质水平显著抑制不同肝癌细胞中β-catenin的表达,在SMMC-7721和HepG-2中在mRNA水平的抑制率分别为：β-catenin-siRNA基因水平最高抑制率在SMMC-7721细胞中为38%,最高抑制率发生于转染后48小时,在HepG-2细胞中为39%,最高抑制率发生于转染后96小时；从蛋白质水平上看在SMMC-7721细胞中的最高抑制率分别为48%,最高抑制率发生转染后72小时,在HepG-2细胞中的最高抑制率为19%,最高抑制率发生转染后96小时。沉默β-catenin基因后MTT法观察到SMMC-7721和HepG-2两株肝癌细胞生长均受到抑制,抑制率分别为：62%和78%。上述结果说明沉默β-catenin基因在基因水平的抑制发生于转染后48小时后,在蛋白水平的抑制发生于转染后72小时后。沉默β-catenin基因可以抑制β-catenin在肝细胞中过度积聚,从而影响肝癌的生长,β-catenin在肝细胞中过度积聚导致Wnt信号转导通路异常活跃,Wnt/β-cateninn信号通路异常活跃参与了肝癌的形成。流式细胞技术检测到沉默β-catenin基因后SMMC-7721细胞生长多被阻滞在GO/G1期,与空白组及阴性对照组存在显著差异（P<0.05）,无时间依赖性。HepG-2细胞生长多被阻滞在GO/G1期,尤其在转染后的96小时出现大量肿瘤细胞的凋亡,呈时间依赖性。说明不同的肝癌细胞系对沉默β-catenin基因后对肝癌细胞的生长均有抑制作用,但阻滞的细胞周期时相及时间不尽相同,Wnt/β-catenin信号转导通路参与调控肝癌细胞的增殖与分化,提示我们可以通过生物手段敲除β-catenin基因抑制肝癌细胞增殖达到治疗肝癌的目的。我们同时应用了流式细胞技术检测了不同肝癌细胞株在沉默β-catenin基因后48h、72h、96h细胞凋亡的情况,流式细胞技术研究结果显示：SMMC-7721细胞凋亡发生在转染后的48小时,72小时后肿瘤细胞再次出现增殖；HepG-2细胞的凋亡发生在48小时,96小时达到高峰。说明沉默肝癌细胞株中的β-catenin基因可以有效的促进肝癌细胞的凋亡,从而起到治疗肝癌的作用。同时也提示我们不同的肝癌细胞凋亡与时间的关系不尽相同,我们分析可能与不同的肝癌细胞系来源的地区不同人种不同有关。实验发现利用RNA干涉技术阻断β-catenin基因的异常高表达可以抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞的凋亡。但在不同的肝癌细胞系其增殖与凋亡出现的时间点、受阻滞时相,生长的抑制率,细胞的凋亡率不尽相同,揭示了单一细胞系的研究局限性,为我们以后的研究提供了新的思路。现阶段对肝癌的治疗方法主要有手术切除治疗、不能切除的术中各种局部治疗：肝动脉插管化疗、介入放射学治疗、免疫治疗、无水酒精注射治疗、激光光动力学治疗、超声引导下微波凝固治疗、导向治疗。我们的实验初步探讨了通过RNA干涉技术阻断肝癌细胞中的β-catenin基因而促进细胞凋亡、抑制肝癌细胞的生长从而达到治疗肝癌的目的,将为肝癌的基因治疗确立新的靶点。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 第2章 综述
• 2.1 Wnt/（β-catenin）信号转导通路的组成
• 2.2 Wnt/β-catenin信号转导通路对细胞的分化增殖的调控
• 2.3 Wnt/β-catenin信号转导通路与细胞周期
• 2.4 Wnt/β-catenin信号转导通路与细胞凋亡
• 2.5 Wnt/β-catenin信号转导通路与肝细胞癌
• 第3章 沉默β-catenin基因对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第4章 沉默β-catenin基因对肝癌细胞SMMC-7721细胞周期的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 第5章 沉默β-catenin基因对肝癌细胞SMMC-7721凋亡相关因子的影响
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果
• 5.3 讨论
• 第6章 沉默β-catenin基因对肝癌细胞HepG-2生长的影响
• 6.1 材料与方法
• 6.2 结果
• 6.3 讨论
• 第7章 沉默β-catenin基因对肝癌细胞HepG-2细胞周期的影响
• 7.1 材料与方法
• 7.2 结果
• 7.3 讨论
• 第8章 沉默β-catenin基因对肝癌细胞HepG-2凋亡相关因子的影响
• 8.1 材料与方法
• 8.2 结果
• 8.3 讨论
• 第9章 结论
• 参考文献
• 作者简介及攻读博士学位期间发表的学术论文
• 致谢