论文题目: 鹿茸多肽对骨髓间质干细胞软骨分化生物学行为的影响
论文类型: 博士论文
论文专业: 中医骨伤科学
作者: 修忠标
导师: 林建华
关键词: 骨性关节炎,中药疗法,骨髓间质干细胞,药物作用,鹿茸多肽,药物作用,分化,药物作用,调亡,药物作用
文献来源: 福建中医学院
发表年度: 2005
论文摘要: 目的:在细胞和分子水平观察鹿茸多肽对骨髓间质干细胞（MSCs）体外分化软骨细胞生物学行为的影响,以优化软骨组织工程的种子细胞,改善软骨的修复质量,并对鹿茸多肽的作用机制进行初步探讨。方法:1.抽取兔骨髓液经密度梯度离心得到的单个核细胞,经体外分离、培养获得兔MSCs。2.采用相差显微镜观察其生长情况,透射电镜观察细胞结构,流式细胞仪检测细胞表面抗原,MTT比色法描绘生长曲线。3.将获得的兔MSCs分成不同药物浓度组并进行药物干预,48h后采用MTT比色、免疫细胞化学、流式细胞仪分析细胞周期等方法,观察鹿茸多肽对MSCs增殖的影响。4.将第3代兔MSCs分为空白对照组、诱导组及鹿茸多肽组,采用原培养液、诱导培养液及含10ug/ml鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养,分别于1、2、3w后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的研究。5.将软骨表型化兔MSCs分为空白对照组、诱导组及鹿茸多肽组,用IL-1β诱导细胞凋亡,并用鹿茸多肽干预。分别于24h、48h、72h后取样。采用透射电镜观察细胞形态,Annexin V法检测细胞凋亡率,RT-PCR分析CasPase-3mRNA表达水平,ELISA检测CasPase-3蛋白酶活性。结果1.原代兔MSCs成均匀分布的簇状生长、形态梭形。在传代培养中形态特性无明显变化、均质性提高。细胞功能活跃,体积大,有大量扩张粗面内质网、高尔基复合体及线粒体。CD34、CD45表达阴性,CD29、CD90表达阳性,证实这些细胞是非造血干细胞。细胞1-3d增殖缓慢,3-5d快速增殖,5-7d趋于平缓,7-9d呈下降趋势。2.10ug/ml鹿茸多肽获得最佳促进MSCs增值效应,且能逆转MSCs在体外连续培养过程中异倍体的产生;在软骨诱导培养条件下其能促进GAG分泌及Ⅱ型胶原mRNA的表达;鹿茸多肽能减少CasPase-3mRNA表达,抑制其蛋白酶活性,降低细胞凋亡率。结论:1.通过体外对MSCs的分离培养与鉴定,可以建立较完善的MSCs培养体系。2.鹿茸多肽在促进MSCs增殖的同时可以减少其异行性的产生,并对MSCs定向软骨分化有明显促进作用。3.CasPase-3参与细胞凋亡,鹿茸多肽通过抑制
论文目录:
目录
中文摘要
英文摘要
引言
第一部分 骨髓间质干细胞的分离培养与鉴定
前言
1．1 材料
1．2 方法
1．2．1 MSCs的分离培养及倒置相差显微镜观察
1．2．2 MSCs透射电镜观察
1．2．3 MSCs表面标记检测
1．2．4 描绘生长曲线
1．2．5 统计学方法
1．3 结果
1．3．1 MSCs形态学观察结果
1．3．2 MSCs表面标记检测结果
1．3．3 MSCs生长曲线分析结果
1．4 讨论
1．5 小结
第二部分 鹿茸多肽对兔骨髓间质干细胞体外增殖的影响
前言
2．1 材料
2．2 方法
2．2．1 MTT比色试验
2．2．2 流式细胞仪检测细胞周期
2．2．3 PCNA表达
2．2．4 统计学方法
2．3 结果
2．3．1 MTT比色试验结果
2．3．2 流式细胞仪检测结果
2．3．3 PCNA表达结果
2．4 讨论
2．5 小结
第三部分 鹿茸多肽对MSCs体外软骨表型诱导分化的影响
前言
3．1 材料
3．2 方法
3．2．1 MSCs的软骨诱导培养
3．2．2 H．E染色显微镜观察
3．2．3 阿力新蓝染色检测 GAG合成
3．2．4 二甲基亚甲蓝显色法测定 GAG含量
3．2．5 RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA表达
3．2．6 统计学方法
3．3 结果
3．3．1 离心管聚集体培养的细胞团块形态学观察结果
3．3．2 硫酸GAG含量测定结果
3．3．3 Ⅱ型胶原mRNA表达检测结果
3．4 讨论
3．5 小结
第四部分 鹿茸多肽对软骨表型化MSCs凋亡的影响
前言
4．1 材料
4．2 方法
4．2．1 软骨表型化MSCs分组诱导培养
4．2．2 透射电镜观察
4．2．3 流式细胞仪检测细胞凋亡率
4．2．4 RT-PCR检测caspase-3 mRNA表达
4．2．5 ELISA分析caspase-3蛋白酶活性
4．2．6 统计学方法
4．3 结果
4．3．1 透射电镜观察结果
4．3．2 细胞凋亡率检测结果
4．3．3 caspase-3 mRNA表达检测结果
4．3．4 caspase-3蛋白酶活性测定结果
4．4 讨论
4．5 小结
结论
参考文献
致谢
附录
附录1 附图
附录2 综述 骨髓间质干细胞软骨分化生物学的影响因素
附录3 在校期间发表论文目录
附录4 在校期间发表论文(第一作者)
附录5 个人简历
发布时间: 2005-10-26
参考文献
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- [3].鹿茸多肽增强体外培养兔关节软骨细胞代谢的实验研究[D]. 李勇.福建中医学院2003
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