牛γ干扰素和白细胞介素4基因的原核表达及其产物的单克隆抗体研制

论文摘要

牛结核病主要由牛型结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis, M. bovis）引起的一种重要人兽共患慢性传染病。牛群感染结核分枝杆菌后,主要产生Th1型的细胞免疫应答,以IFN-γ的产生为特征,通过激活巨噬细胞的杀菌活性以抑制或清除体内的细菌,通常情况下病原菌不能被清除,而是被控制在一定区域,疾病进入潜伏期。研究发现随着结核病病情的发展,机体免疫应答逐渐由Th1型转向Th2型,伴随着细胞免疫应答的减弱和体液免疫应答的增强,后者是以IL-4的产生为主要特征。因此IFN-γ和IL-4是牛结核免疫应答中两个重要的细胞因子。为此本研究构建了原核表达牛IFN-γ和IL-4蛋白的重组大肠杆菌,获得相应的融合蛋白,并制备其特异性单克隆抗体。为研究分枝杆菌等牛传染病的致病机理、免疫机制和建立快速检测技术提供了重要条件。同时,牛IFN-γ和IL-4单克隆抗体的获得为研究牛的免疫生物学、免疫应答和免疫调控提供了有力的工具。一、牛γ干扰素和白细胞介素4基因的原核表达及其产物特性在实验室前期构建的重组菌BL21（pGEX-6p-1-BoIFN-γ）和BL21（DE3）（pET- BoIFN-γ）基础上,对两种重组菌进行了诱导表达,两种融合蛋白均主要以可溶性形式表达。经亲和层析对重组蛋白纯化后,SDS-PAGE鉴定结果表明表达蛋白rGST-BoIFN-γ、rHis-BoIFN-γ与预期的大小一致。通过PCR将编码不含信号肽的牛白细胞介素4蛋白的基因从重组质粒pSP73-BoIL-4中克隆出来,分别克隆入表达载体pGEX-6p-1和pET-30a （+）,将重组质粒转入DH5α,测序鉴定。测序鉴定正确后将重组质粒转入表达菌,构建出重组菌BL21（pGEX-6p-1-BoIL-4）和BL21（DE3）（pET-BoIL-4）。对重组菌的诱导表达发现两种重组蛋白均以包涵体形式表达。通过对包涵体的变性与复性得到了相应的纯化蛋白,SDS-PAGE鉴定表明得到的蛋白与预期的大小一致。二、牛γ干扰素和白细胞介素4单克隆抗体的制备与鉴定应用淋巴细胞杂交瘤技术,用纯化的重组蛋白rHis-BoIFN-γ、rHis-BoIL-4分别免疫7周龄BALB/c小鼠,腹部皮下和腹腔免疫,100μg/只。首免时,抗原与等量弗氏完全佐剂混合乳化经腹部皮下免疫;二免时抗原与等量不完全弗氏佐剂混合乳化经腹部皮下免疫;三免时用抗原通过腹腔直接免疫;间隔为两周;尾静脉加强免疫不加佐剂的抗原,100μg/只,3d后,取免疫鼠脾细胞和骨髓瘤SP2/0-Ag-14细胞进行融合。纯化的rGST-BoIFN-γ和rGST-BoIL-4分别作为检测抗原,用间接ELISA方法筛选阳性克隆。获得13株稳定分泌BoIFN-γMcAb的细胞株,命名为1C12、1F7、1G5、3E6、4D5、5E11、5G4、6F8、6G6、7E9、8D3、8F8、9G11,腹水的效价依次为640000、160000、640000、320000、160000、320000、2560000、2560000、320000、640000、80000、2560000、10000,除5G4 McAb亚类为IgG2b外,其余均为IgG1。获得7株稳定分泌BoIL-4 McAb的细胞株,命名为2B8、4A10、5D6、5D8、7G10、8B7、10F8,腹水的效价依次为5000、160000、10000、640000、5000、40000、5000、40000,McAb亚类均为IgG1。Dot-ELISA试验表明,所得单抗只与相应的融合蛋白反应,与其它融合蛋白和对照细菌不反应,显示良好的特异性。Western-blot试验显示所得单抗均能与相应的融合蛋白发生反应,出现特异性条带。单抗与牛IFN-γ和牛IL-4标准品的ELISA反应显示所获单抗均能与标准品反应,显示了良好的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1 牛 IFN-γ、IL-4 与牛结核免疫检测
• 1.1 牛IFN-γ编码基因、结构及其在结核免疫中的作用
• 1.2 牛IL-4 编码基因、结构及其在结核免疫中的作用
• 2 结核免疫
• 2.1 结核的细胞免疫应答
• 2.2 结核的体液免疫应答
• 3 细胞介导免疫应答用于牛结核病的诊断
• 4 结核诊断性抗原
• 5 TST 与IFN-γ试验的比较
• 6 结核免疫与疾病发展
• 参考文献
• 第二章 牛γ干扰素和白细胞介素4 基因的原核表达及其产物的纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 BoIL-4 基因的PCR 扩增及质粒构建
• 2.2 重组菌表达产物的SDS-PAGE 分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 牛γ干扰素和白细胞介素4 单克隆抗体的制备及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与试剂
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 杂交瘤细胞株的建立
• 2.2 单抗生物学特性
• 3 讨论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 致谢