论文摘要
本研究以四川农业大学动物医学院微生物实验保存的猪源枯草芽孢杆菌H6-3菌株（H6-3）作为实验材料,对菌株的营养需求和产酶培养条件进行了优化,研究了该菌株所产中性蛋白酶的最佳酶活力的作用条件、增强和抑制酶活力的影响因子。以豆粕、菜粕和玉米粉为原料,分析了该菌株中性蛋白酶降解饲料蛋白的能力。同时,对H6-3的中性蛋白酶基因进行PCR扩增。试验选用多种的碳源、氮源和无机盐对H6-3菌株产酶的营养需求进行了单因素实验,然后针对葡萄糖、寡聚糖、蛋白胨、酵母膏和磷酸氢二钾五因素,按L16（45）进行正交试验,确定了H6-3菌株最佳产酶培养基的成分是：葡萄糖10g/L,寡聚糖5g/L,蛋白胨15g/L,酵母膏5g/L和磷酸二氢钾5g/L。试验对H6-3菌株的培养条件（温度、pH、接种量和装载量）进行了优化,得到的最佳产酶培养条件为：温度39℃,pH 7.5,接种量1%（V/V）,装载量40mL/100mL和最佳产酶时间为60h。通过对H6-3中性蛋白酶的稳定性和耐受性的研究,得到该酶的最适作用温度为60℃,最适pH为7.0,能耐受0.5%的胆盐。该酶在60℃保温1h后活力有所下降,但仍保持了60%的酶活力。在pH6.0～8.0保温2h酶活力仍保持在80%以上。在胆盐浓度0.5%放置2h后酶活力保持48.44%。除Mg2+对蛋白酶活性有显著促进作用,Hg+和Fe2+对蛋白酶活性有抑制作用。乙二胺四乙酸（EDTA）、邻菲绕啉（OP）和二甲基亚砜（DMSO）对酶活性有不同程度的抑制作用。豆粕、菜粕和玉米三种饲料原料经H6-3中性蛋白酶酶解后,与加入灭活酶的对照组相比,蛋白质降解度显著提高,中性蛋白酶添加剂量为50IU/g时,单位（100IU）酶提高的水解度分别为34.74%、35.70%和55.54%,氮溶指数和三氯乙酸氮溶指数明显增加、平均肽链大幅下降。H6-3培养液,经过滤、硫酸铵分级盐析、Econo-Pac Macro-Prep High Q禺子交换层析分离纯化后,比活力提高了8.56倍,经SDS-PAGE电泳分析获得单一条带,分子量约为40.92KD。以H6-3菌株的基因组DNA为模板,成功扩增出编码枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的基因,序列测序测定结果与已报道的Bacillus sp.RH219 nprE序列同源性达100%。本研究通过对H6-3菌株营养需求和产酶条件的优化,显著提高了菌株产酶量,所产中性蛋白酶有较好的稳定性和较强耐受性,对豆粕、菜粕和玉米三种饲料原料中的蛋白质有很强的降解能力,能显著提高饲料原料中蛋白质的水解度,表明其具备在饲料领域应用的潜质。