小麦WRKY基因的克隆、表达分析及其遗传转化

论文摘要

WRKY转录因子是植物转录调控子家族成员之一,它可以特异地与W-box的结合,并调控启动子中含W-box元件的抗病、损伤、衰老相关基因的表达,进而广泛参与植物对生物胁迫和非生物胁迫的响应。本研究首先利用植物WRKY蛋白的保守序列在小麦基因组数据库中搜索出大量高相似性的ESTs,并拼接获得多条全长序列。通过设计特异引物,采用PCR技术成功克隆到一条小麦WRKY基因的cDNA全长序列。对该基因的序列比对结果显示:它与小麦的TaWRKY53a和TaWRKY53b的序列有较高的相似度,说明此基因确实为小麦中的WRKY基因,并命名为TaWRKY53c。进而对其进行生物信息学分析发现,TaWRKY53c蛋白具有两个完整的WRKY结构域和锌指结构,属于典型的WRKY转录因子Ⅰ类成员。且在与拟南芥Ⅰ类WRKY蛋白的多序列比对中发现,该蛋白与AtWRKY33亲缘进化关系较近,文献报道AtWRKY33参与拟南芥的抗盐响应,因此认为它在小麦中可能参与该蛋白相似的信号通路。小麦幼苗经高盐胁迫处理后,TaWRKY53c表达的组织及时空特异性的荧光定量PCR分析结果表明,该基因确实参与对高盐胁迫的响应,且短时间内表达量增加九倍,并且在叶片中的表达量最高。为获得具有抗盐特性的转基因小麦品种,构建了TaWRKY53c的过表达载体,并利用基因枪技术将其转化到小麦盾片中。再通过组织培养,获得了大量再生植株,以备后续转基因植株筛选。本论文的研究结果对阐明小麦中TaWRKY53c基因的生物学功能奠定了初步的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 WRKY 转录因子研究进展
• 1.2 WRKY 转录因子的结构特点
• 1.3 WRKY 转录因子的生物学功能
• 1.4 WRKY 转录因子的作用机理
• 1.5 植物界中的WRKY 转录因子
• 1.6 本研究目的及意义
• 2 方案及材料
• 2.1 研究方案
• 2.2 材料及来源
• 2.3 生物信息数据库及工具软件
• 2.4 其它材料
• 3 方法
• 3.1 WRKY 基因序列的筛选
• 3.2 小麦RNA 提取、模板制备
• 3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 3.4 WRKY 转录因子的克隆
• 3.5 WRKY 转录因子的生物信息学分析
• 3.6 WRKY 蛋白的亚细胞定位
• 3.7 胁迫处理及WRKY 基因表达分析
• 3.8 载体构建
• 3.9 基因枪转化技术及组织培养
• 3.10 GUS 组织瞬时表达检测
• 4 结果及分析
• 4.1 小麦中国春（Chinese Spring）总RNA 提取及模板制备
• 4.2 TaWRKY 基因的克隆、检测及测序
• 4.3 TaWRKY53c 的生物信息学分析
• 4.4 TaWRKY53c 亚细胞定位
• 4.5 TaWRKY53c 的时空表达分析
• 4.6 真核载体构建
• 4.7 幼胚盾片的培养及植株再生
• 4.8 GUS 组织化学检测
• 5 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献