基质中β-葡聚糖酶活力测定方法的研究

论文摘要

β-葡聚糖是自然合成的多聚糖,属植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖,是以右旋葡萄糖为基本单位,具有线型的空间结构,存在于禾谷类中的糊粉层和胚乳细胞中。β-葡聚糖的结构中含有β-1,3和β-1,4两种糖苷键,前者的存在导致了纤维素分子的不规则排序,使得这些物质在生理、化学特性、水溶性方面都有一定的差异。在低浓度时,β-葡聚糖与水分子相互作用增加了溶液的粘度,随着其浓度的增加,则β-葡聚糖分子本身缠成网状结构,引起溶液粘度大大增加,当达到一定程度时可能形成凝胶。β-葡聚糖酶对β-葡聚糖具有重要的水解作用,能使其降解为低分子量片段,失去亲水性和粘性。因此β-葡聚糖酶在食品工业,如制糖工业;发酵工业,如啤酒糖化、啤酒麦芽汁生产等;以及饲料工业中到得到了广泛的应用。但是在应用和流通流域存在很大问题:酶活力单位不一致。由于目前广泛采用的测定β-葡聚糖酶活力的方法是DNS（3,5-二硝基水杨酸）法,该方法灵敏度较低,在很多的应用领域用该方法都测不出酶活力;底物要求很高,一般浓度都在1%,造成成本较高,也测不出初速度,并且该方法产生的寡糖摩尔吸光系数不一致,造成酶浓度曲线不成线性。本论文所采用的MBTH（苯丙噻唑酮腙）法不但灵敏度高,底物浓度要求低,而且能进行微量测定,因此将会在饲料、食品、医药、纺织、植物病害防治等领域得到广泛的应用。本论文主要包括以下研究内容:1.建立MBTH法测定β-葡聚糖酶活力的新方法首先对β-葡聚糖底物的配制进行研究;然后研究底物对酶催化反应的影响;最后确定了酶催化反应的参数。结果表明:该方法测得的Km值较小,即本实验该试验所用的β-葡聚糖酶和β-葡聚糖亲和力较大,酶活力测定更准确可靠,且可大幅度降低底物浓度,从而节约测定成本;另外MBTH法回收率较好,精密度和灵敏度较高,不存在还原剂的干扰,而且能用于微量酶活力测定。2.对MBTH法、DNS法和S-N法在β-葡聚糖酶活力方面进行比较研究分别用MBTH法、DNS法、S-N（Somogyi-Nelson）法测定β-葡聚糖酶的酶动力学曲线;然后从检测限、定量限、回收率及精密度等方面对这三种方法进行比较,结果表明:S-N法操作繁琐、灵敏度较低,DNS法无法测定酶解初速度,且都不能进行微量酶活力测定,MBTH法弥补了上述两种方法的不足,且节约成本,因此将会得到广泛的应用。3.MBTH法在基质中酶活力测定中的应用研究MBTH法测定基质中β-葡聚糖酶活力。该基质来源于饲料、海参体壁提取液等。饲料溶液的提取:溶解、磁力搅拌、离心等。海参体壁提取液的提取:匀浆、缓冲液浸提、盐析、透析等。4.高通量分析法测定β-葡聚糖酶活力首先用MBTH法与微孔板测定手段相结合的分析法测定还原糖标准曲线;然后建立β-葡聚糖酶浓度标准曲线;最后将其应用于饲料中的酶活力测定。结果表明:微孔板法较试管法灵敏度稍低,但酶浓度对反应速度的曲线的斜率和试管法基本一致;且该方法在饲料酶活力测定中检测限和定量限较低,能进行微量酶活力测定;该方法一次能处理大量的样品,且所需试剂量较少,在实现高通量分析的同时,大幅度降低了测定成本。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 β-葡聚糖酶简介
• 1.1.1 β-葡聚糖酶的类型
• 1.1.2 β-葡聚糖酶的来源及酶学活性
• 1.1.3 β-葡聚糖酶的结构
• 1.1.4 β-葡聚糖酶的应用
• 1.1.4.1 β-葡聚糖酶在制糖工业的应用
• 1.1.4.2 β-葡聚糖酶在植物防病害中的应用
• 1.1.4.3 β-葡聚糖酶在发酵工业中应用
• 1.1.4.3.1 β-葡聚糖酶在啤酒糖化工艺中的应用
• 1.1.4.3.2 β-葡聚糖酶在啤酒麦芽生产中的应用
• 1.1.4.4 β-葡聚糖酶在饲料工业中的应用
• 1.1.4.4.1 β-葡聚糖酶在猪饲料中的应用
• 1.1.4.4.2 β-葡聚糖酶在家禽饲料中的应用
• 1.1.4.4.3 β-葡聚糖酶在鱼类饲料中的应用
• 1.1.4.5 β-葡聚糖酶在其他方面的应用
• 1.2 饲用酶制剂简介
• 1.2.1 饲用酶制剂的类型
• 1.2.2 饲用酶制剂活力测定的影响因素
• 1.2.2.1 底物性质对饲用酶活力测定的影响
• 1.2.2.2 反应体系的离子强度对饲用酶制剂活力测定的影响
• 1.2.2.3 饲料样品中的提取对饲用酶制剂活力测定的影响
• 1.2.2.4 碳水化合物对饲用酶制剂活力测定的影响
• 1.2.3 开发应用饲用酶制剂的意义
• 1.3 β-葡聚糖酶活力测定方法的研究
• 1.3.1 粘度法
• 1.3.2 琼脂糖扩散法
• 1.3.3 生色底物法
• 1.3.4 酶联吸附分析法
• 1.3.5 还原端基法
• 1.3.5.1 方法概述
• 1.3.5.1.1 DNS法
• 1.3.5.1.2 Somogyi-Nelson5法（S-N5法）
• 1.3.5.1.3 PAHBAH法
• 1.3.5.1.4 BCA去
• 1.3.5.1.5 MBTH法
• 1.3.5.2 测定手段
• 1.3.5.2.1 试管法
• 1.3.5.2.2 灌法
• 1.3.5.2.3 微孔板法
• 1.3.5.2.4 流动注射法（Flow-injection Analysis,FIA）
• 1.3.6 其他可能用于β-葡聚糖酶活力测定的方法
• 1.3.6.1 安培法
• 1.3.6.2 等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry）
• 1.3.7 结论
• 1.4 研究的目的和意义
• 第二章 MBTH法测定β-葡聚糖酶活力的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.1.3 试验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 MBTH法测定参数的优化
• 2.2.1.1 测定还原糖条件优化
• 2.2.1.1.1 加热时间的确定
• 2.2.1.1.2 模拟酶解反应葡萄糖标准曲线的绘制
• 2.2.1.2 酶解液测定条件的优化
• 2.2.1.2.1 不同pH对酶活力的影响
• 2.2.1.2.2 不同反应温度对反应速率的影响
• 2.2.1.2.3 底物浓度的影响及Km值的计算
• 2.2.2 β-葡聚糖酶浓度曲线的建立及初步方法验证
• 2.2.2.1 β-葡聚糖酶浓度曲线的建立
• 2.2.2.2 加标回收率及精密度的测定
• 2.2.2.3 检测限的测定
• 2.3 小结
• 第三章 三种测定β-葡聚糖酶活力的方法比较
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 仪器与设备
• 3.1.3 试验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 三种方法的模拟酶解反应的葡萄糖标准曲线
• 3.2.1.1 MBTH法与经典DNS法、S-N法的比较
• 3.2.1.2 测定木聚糖酶活力的国标DNS法测定葡萄糖与经典DNS法的比较
• 3.2.2 三种方法的酶浓度标准曲线
• 3.2.2.1 DNS法测定β-葡聚糖酶活力
• 3.2.2.1.1 加碱终止酶催化反应的DNS法
• 3.2.2.1.2 参照木聚糖酶活力测定的国标法测定β-葡聚糖酶浓度曲线
• 3.2.2.2 S-N法
• 3.2.2.3 MBTH法
• 3.2.3 回收率及精密度的比较
• 3.2.4 检测限的比较
• 3.3 小结
• 第四章 基质中β-葡聚糖酶活力测定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 仪器与设备
• 4.1.3 试验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 不同浸提方法对饲料本身稳定性的影响
• 4.2.2 磁力搅拌过程对酶活力测定的影响
• 4.2.3 样品预处理对酶活力测定的影响
• 4.2.4 饲料样品的酶活力测定
• 4.2.5 饲料中酶浓度曲线的建立
• 4.2.6 批间精密度的计算
• 4.2.7 回收率的计算
• 4.3 结论
• 第五章 高通量分析法测定β-葡聚糖酶活力
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与试剂
• 5.1.2 仪器与设备
• 5.1.3 溶液配制
• 5.1.4 试验方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 不同混匀方法的比较
• 5.2.2 葡萄糖标准曲线的测定
• 5.2.3 β-葡聚糖酶浓度曲线的建立
• 5.2.4 方法验证
• 5.2.4.1 检测限及定量限的计算
• 5.2.4.2 回收率的测定
• 5.2.5 高通量分析法在饲料样品测定中的应用
• 5.2.5.1 A样品酶活力测定
• 5.2.5.2 饲料中β-葡聚糖酶浓度曲线的建立
• 5.2.5.3 初步的方法验证的研究
• 5.2.5.3.1 检测限及定量限的计算
• 5.2.5.3.2 回收率的计算
• 5.3 小结
• 结论
• 本文创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文和申请的专利