马钱子碱对体外软骨细胞凋亡线粒体途径的研究

论文摘要

目的:建立体外培养鼠软骨细胞的体系,应用体外培养的鼠软骨细胞一氧化氮诱导其凋亡,在细胞和分子水平上观察中药马钱子主要单体成分马钱子碱（Strychnine）影响体外SD大鼠软骨细胞凋亡的作用机制,从而探讨马钱子碱治疗骨关节炎的机理。方法:分离SD大鼠的软骨细胞,通过体外培养,进行形态学观察,对原代软骨细胞进行Ⅱ型胶原鉴定,建立鼠软骨细胞的体外培养体系,为实验提供应用细胞;将体外培养的SD大鼠软骨细胞分为5组,分别加入培养液、凋亡诱导剂NO供体—硝普钠（SNP）2mmol/L,再加入不同剂量的马钱子碱,分为:空白对照组,SNP组（模型对照组）,SNP+高剂量马钱子碱组（500mg/L）,SNP+中剂量马钱子碱组（250mg/L）,SNP+低剂量马钱子碱组（125mg/L）。混合培养20小时后,流式细胞仪Annexin-V/PI检测软骨细胞早期与晚期凋亡率,分析比较马钱子碱影响软骨细胞凋亡的主要作用时期。同时对马钱子碱影响体外软骨细胞凋亡的线粒体途径进行初步探讨,主要采用免疫组织细胞化学法检测细胞色素C（cytochrome c,CytC）的表达情况,Western免疫印迹法观察与细胞凋亡主要相关蛋白之一Smac的表达。结果:体外培养的鼠软骨细胞有Ⅱ型胶原表达,说明培养的细胞为软骨细胞;SNP诱导软骨细胞凋亡,其早期凋亡率为26.85±2.01,晚期凋亡率为13.14±2.19;马钱子碱明显抑制软骨细胞凋亡,其凋亡率随马钱子碱剂量增大而降低,与SNP组比较,P<0.05;马钱子碱各剂量组早期凋亡率明显高于晚期凋亡率,并且与晚期凋亡率相比较,P<0.05,差异有统计学意义;SNP组中细胞色素C在大部分软骨细胞浆中均有表达,且阳性细胞着色较深,表达率为2.6±0.55,马钱子碱组随着浓度增大,细胞色素C表达明显减少,着色逐渐减弱。各组与空白组比较,F=15.588,P<0.05,有统计学意义;Western免疫印迹显示,SNP处理后发现马钱子碱在抑制细胞凋亡过程中随着浓度的增大,Smac的活性呈明显降低趋势。结论: SNP诱导SD大鼠软骨细胞凋亡,马钱子碱能明显降低其凋亡率,并随着马钱子碱剂量的增大,凋亡率逐渐降低,尤其是早期凋亡率;CytC与Smac在正常软骨细胞浆中基本不表达,当凋亡发生时,表达明显增加,马钱子碱抑制凋亡的同时,随着剂量的增大,逐渐阻挡了其从线粒体的释放;由此,我们推测,马钱子碱抑制SNP诱导的鼠软骨细胞凋亡,其保护软骨的作用可能是通过线粒体通路实现。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究内容
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 实验结果
• 3.1 软骨细胞生长情况
• 3.2 软骨细胞鉴定结果
• 3.3 各组间软骨细胞凋亡率的比较
• 3.4 各组大鼠软骨细胞线粒体细胞色素 C 的释放情况
• 3.5 各组大鼠软骨细胞线粒体凋亡诱导因子 Smac 的释放情况
• 4 讨论
• 4.1 软骨细胞的体外培养与鉴定
• 4.2 骨关节炎与软骨细胞凋亡及凋亡模型的建立
• 4.3 马钱子碱对SD 大鼠软骨细胞凋亡及线粒体信号传导的影响
• 5 结论
• 6 参考文献
• 附录
• 致谢
• 课题综述
• 参考文献