芽孢杆菌（Bacillus spp.）拮抗菌株的筛选及TasA基因研究

论文摘要

本论文筛选和鉴定了芽孢杆菌的拮抗菌株，探讨了接种芽孢杆菌提高甘薯对蔓割病菌抗性的光合作用机制和保护酶系统的启动机制，构建了枯草芽孢杆菌绿色荧光蛋白高效表达载体，并从枯草芽孢杆菌168菌株中克隆和表达了抗菌蛋白。结果如下： （1）以植物根际分离到的41株芽孢杆菌菌株为对象，分别测定了其对植物病原真菌和细菌的拮抗效果，从中筛选出11株对植物病原菌抑制率较高的菌株，即AB、V3、SAI、3-1、N8-b、25-1、25-5、25-6、25-9、25-15、25-17。并分别研究了对甘薯蔓割病菌（Fusarium．oxysporumf．sp．batatas）、小白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、立枯丝核菌（Rhizoctonia soIani）、辣椒疫霉病菌（Phvtophthora capsici）的抑菌作用，其中着重研究了菌株25-5、25-6、25-9、25-15、25-17对甘薯蔓割病菌、小白菜黑斑病菌，菌株25-1、25-17对香蕉炭疽病菌的作用机理。结果表明：平板对峙培养出现明显的抑菌环；以凹玻片法，用菌株培养滤液处理病原菌分生孢子，其孢子萌发率明显降低；将细菌培养滤液和孢子悬浮液涂布于PDA平板上，培养滤液均能抑制病菌分生孢子的形成。普通光学显微镜和油镜观察显示，菌株均可抑制病菌菌丝生长，造成菌丝分支增多，顶端和中央膨大，随着时间的延长畸变结构增加，菌丝呈念珠状或菌丝分支显著增多，且顶端细胞变形膨大聚集成簇，菌丝壁穿洞，内含物质泄漏，终使细胞崩解和消融，变成球状的空泡。 （2）以芽孢杆菌菌株25-5、25-6、25-9、25-15、25-17为材料，探讨了接种芽孢杆菌提高甘薯对蔓割病菌抗性的光合作用机制和保护酶系统启动机制，结果表明：接种芽孢杆菌后的甘薯叶片光合速率、气孔导度、蒸腾速率均明显高于对照，这些作用随蔓割病病原菌的浓度升高而下降，处理间表现一致；同时降低了MDA含量，提高植株的活性氧保护酶系统代谢水平。但是经培养基处理的甘薯叶片光合速率、活性氧保护酶系统代谢水平却反而下降，说明接种芽孢杆菌可以有效提高甘薯的光合作用，增强抵御蔓割病菌的能力。 （3）构建了枯草芽孢杆菌绿色荧光蛋白高效表达载体，将枯草芽孢杆菌组成型启动子P43克隆到枯草芽孢杆菌—大肠杆菌穿梭载体pGFP4412中，构建了携带绿色荧光蛋白的重组质粒pP43GFP，结果发现枯草芽孢杆菌组成型启动子P43启动绿色荧光蛋白基因在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌表达，成功地对枯草芽孢杆菌模式菌株BS168进行了标记，为进一步用gfp基因标记植病生防枯草芽孢杆菌和外源蛋白表达打下技术基础。 （4）利用大肠杆菌——枯草芽孢杆菌穿梭表达载体P43GFP将TasA基因与枯草芽

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 生物防治的重要性
• 1.2 生防微生物的应用
• 1.2.1 微生物防治的研究进展
• 1.2.2 微生物防治的优点和制剂种类
• 1.2.3 微生物防治中生防细菌的应用
• 1.3 芽孢杆菌在生物防治中的应用
• 1.3.1 芽孢杆菌的特点
• 1.3.2 芽孢杆菌的分类
• 1.3.3 芽孢杆菌作为生防菌的应用
• 1.3.4 芽孢杆菌拮抗作用
• 1.3.4.1 芽孢杆菌拮抗作用和产生的拮抗物质种类
• 1.3.4.2 芽孢杆菌细菌素的应用优势
• 1.3.4.3 芽孢杆菌抗菌蛋白的应用前景
• 1.4 枯草芽孢杆菌的应用
• 1.4.1 枯草芽孢杆菌在生物防治上的重要意义
• 1.4.2 枯草芽孢杆菌作为科学研究的意义
• 1.4.3 枯草芽孢杆菌的生防制剂
• 1.4.4 枯草芽孢杆菌的抑菌机理
• 1.4.4.1 竞争作用
• 1.4.4.2 诱导抗病性（ISR）
• 1.4.4.3 促生作用
• 1.4.4.4 拮抗作用
• 1.4.5 枯草芽孢杆菌的抑菌物质
• 1.4.5.1 细菌素
• 1.4.5.2 抑菌蛋白
• 1.4.6 内生枯草芽孢杆菌的抑菌机理
• 1.4.6.1 在植物体内的定殖检测
• 1.4.6.2 防病机制
• 1.5 抗菌蛋白基因的原核表达
• 1.6 绿色荧光蛋白（GFP）基因及其在原核生物中的应用
• 1.6.1 GFP的性质和结构
• 1.6.2 GFP在原核生物研究中的应用
• 1.6.3 GFP与原核生物基因的表达
• 1.6.4 GFP与细菌生态学
• 1.7 甘薯蔓割病的研究进展
• 1.8 本研究的目的意义
• 2 芽孢杆菌的筛选和作用机理
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 供试芽孢杆菌菌株
• 2.1.1.2 供试真菌菌株
• 2.1.1.3 供试细菌菌株
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 芽孢杆菌拮抗菌的筛选
• 2.1.2.2 芽孢杆菌抑菌机理的研究
• 2.1.2.3 芽孢杆菌菌株的生长曲线测定
• 2.1.2.4 芽孢杆菌16SrRNA鉴定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 芽孢杆菌拮抗菌株的筛选
• 2.2.2 芽孢杆菌对细菌的拮抗作用
• 2.2.3 芽孢杆菌对甘薯蔓割病菌的抑菌机理
• 2.2.3.1 对甘薯蔓割病菌抑制作用
• 2.2.3.2 挥发性代谢物质对甘薯蔓割病菌菌丝的拮抗作用
• 2.2.3.3 对甘薯蔓割病菌分生孢子形成抑制作用
• 2.2.3.4 对甘薯蔓割病菌分生孢子萌发抑制作用
• 2.2.3.5 芽孢杆菌25-9菌株的生长曲线
• 2.2.3.6 芽孢杆菌处理后甘薯蔓割病菌菌丝的变化
• 2.2.4 芽孢杆菌对香蕉炭疽病病菌抑菌机理的研究
• 2.2.4.1 对菌丝生长速率的影响
• 2.2.4.2 对分生孢子萌发的抑制作用
• 2.2.4.3 对病菌生长的抑制作用
• 2.2.4.4 对菌丝形态的影响
• 2.2.5 芽孢杆菌对小白菜黑斑病菌的抑菌机理
• 2.2.6 芽孢杆菌的分子生物学鉴定
• 2.3 小结和讨论
• 2.3.1 拮抗菌的筛选
• 2.3.2 芽孢杆菌抑菌机理
• 2.3.2 芽孢杆菌菌株培养滤液的抑菌效果
• 2.3.3 室内平板拮抗作用与活体测试效果比较
• 2.3.4 关于优良拮抗菌株混合培养的一点设想
• 3 芽孢杆菌防治甘薯蔓割病的生理机制
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 供试甘薯品种
• 3.1.1.2 供试菌株
• 3.1.1.3 接种和取样方法
• 3.1.2 测定方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 芽孢杆菌对甘薯感染蔓割病后光合作用的影响
• 3.2.1.1 对叶片叶绿素含量及组成的影响
• 2浓度、净光合速率的变化'>3.2.1.2 叶片气孔导度、蒸腾速率、胞间CO₂浓度、净光合速率的变化
• 3.2.2 芽孢杆菌对甘薯感染蔓割病后脂质过氧化的影响
• 2O₂含量的影响'>3.2.2.1 对叶片H₂O₂含量的影响
• 3.2.2.2 对叶片丙二醛含量的影响
• 2产生速率的影响'>3.2.2.3 对叶片O₂产生速率的影响
• 3.2.2.4 对叶片电导率的影响
• 3.2.2.5 对叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响
• 3.2.2.6 对叶片过氧化物酶（POD）活性的影响
• 3.2.2.7 对叶片过氧化氢酶（cAT）活性的影响
• 3.2.3 芽孢杆菌对甘薯感染蔓割病后盆栽试验效果
• 3.3 小结与讨论
• 4 枯草芽孢杆菌绿色荧光蛋白高效表达载体的构建
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 制备模板
• 4.1.2.2 引物
• 4.1.2.3 热循环参数
• 4.1.2.4 遗传转化与基因重组
• 4.1.2.5 工程菌株发光表型观察
• 4.1.2.6 工程菌株稳定性测定
• 4.2 结果
• 4.2.1 重组质粒的构建
• 4.2.2 P43测序列比对结果
• 4.2.3 芽孢杆菌标记系统的构建
• 4.2.4 质粒遗传稳定性检测
• 4.3 讨论
• 5 抗菌蛋白基因TasA的克隆与表达
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 试剂盒
• 5.2 方法
• 5.2.1 枯草芽孢杆菌BS168基因组的提取
• 5.2.2 PCR反应
• 5.2.2.1 PCR引物
• 5.2.2.2.PCR反应体系
• 5.2.2.3 反应条件
• 5.2.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 5.2.3 PCR产物胶回收
• 5.2.4 重组表达质粒p43TasA的构建及DNA序列测序
• 5.2.4.1 双酶切目的DNA与载体p43GFP
• 5.2.4.2 从琼脂糖凝胶中回收目的DNA与载体p43GFP
• 5.2.4.3 目的DNA与载体p43GFP连接
• 5.2.4.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 5.2.4.5 重组质粒提取,PCR和酶切验证
• 5.2.4.6 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化
• 5.2.4.7 枯草芽孢杆菌质粒的提取
• 5.2.4.8 枯草芽孢杆菌质粒PCR及酶切验证
• 5.2.4.9 DNA序列测定及分析
• 5.2.5 工程菌蛋白质表达
• 5.2.5.1 蛋白质的表达
• 5.2.5.2 SDS-PAGE
• 5.2.6 工程菌抑菌谱测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 PCR扩增TasA基因
• 5.3.2 重组质粒p43-TasA克隆子PCR和酶切鉴定
• 5.3.3 DNA序列测定及分析
• 5.3.4 工程菌质粒的PCR及酶切鉴定
• 5.3.5 工程菌蛋白质表达
• 5.3.6 工程菌抑菌谱测定
• 5.4 讨论
• 5.4.1 关于枯草芽孢杆菌抑菌蛋白的应用
• 5.4.2 克隆条件的探索
• 5.4.3 TasA的表达
• 5.4.4 研究工作展望
• 小结
• 参考文献
• 缩写词和英汉对照
• 攻博期间发表和整理的论文
• 致谢