H5N1禽流感病毒抗原特性及流感病毒混合感染对小鼠的致病性分析

论文摘要

2009年4月,墨西哥爆发新型A型H1N1流感病毒（2009 H1N1）,并迅速扩散至全世界,发展成为21世纪第一次人流感大流行。自从1997年以来,H5N1亚型高致病性禽流感病毒（HPAI）已经在东南亚家禽中大量爆发,并已造成大量鸡死亡。这些疫情伴随着零星的HPAI H5N1病毒感染人,并导致大于50%的死亡率。为了阐明H5N1禽流感病毒抗原特性及H1N1-H5N1混合感染对BALB/c小鼠这一哺乳动物模型的致病性,现将主要研究内容和结果报告如下：1.H5N1禽流感病毒抗原特性分析本研究主要分析2004年及2006-2007年病毒的抗原特性。血凝抑制试验和病毒中和试验结果表明两个时期的病毒有非常明显的抗原特性差异。病毒HA基因的遗传进化分析揭示它们处于不同的分支。晶体模型同样说明本研究发现的大多数氨基酸突变位点在HA蛋白球状头部,甚至一些位点刚好位于抗原表位。本研究表明2006-2007年病毒发生了较大范围的抗原漂移。2.流感病毒混合感染对小鼠的致病性在本研究中,将人H1N1流感病毒LN和禽H5N1流感病毒HM,分别或混合感染小鼠分析存活率、死亡率、MDT规律、体重变化规律、临床症状、病理变化和小鼠感染病毒后肺脏炎性因子（IL-1β, IFN-γ, TNF-α）表达情况。结果表明,LN病毒单独感染不能致死小鼠；HM病毒单独感染和LN-HM混合感染均导致小鼠在第6天全部死亡,但感染LN 48h后再感染HM组的MDT最短,小鼠存活率下降最快。LN组病理变化不明显,HM组和混合感染组病变明显,但其差异不显著；LN病毒感染小鼠后仅能刺激较弱的IL-1β, IFN-γ, TNF-α表达,HM病毒和混合感染均能刺激强烈的IL-1β, IFN-γ, TNF-α表达。本研究表明混合感染增强对小鼠的致病性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1. 文献综述
• 1.1 H5N1流感病毒的爆发及生物学特性
• 1.1.1 流感病毒
• 1.1.2 禽流感病毒
• 1.1.3 高致病性H5N1禽流感病毒的爆发
• 1.1.4 中国的HPAI H5N1流感病毒
• 1.1.4.1 遗传进化分析
• 1.1.4.2 青海湖疫情
• 1.1.4.3 猪感染情况
• 1.1.4.4 人感染H5N1病毒情况
• 1.1.5 HPAI H5N1病毒的传播
• 1.1.6 决定H5N1病毒毒力、致病力和宿主范围的分子机制
• 1.1.6.1 HA
• 1.1.6.2 PB2
• 1.1.6.3 NS1
• 1.1.6.4 PB1-F2
• 1.2 H5N1流感病毒HA结构研究进展
• 1.2.1 结构概述
• 1.2.2 H5N1抗原变异
• 1.2.3 受体结合区域
• 1.2.4 RBD突变分析
• 1.3 H5N1禽流感病毒抗原表位研究进展
• 1.4 HA抗原表位研究进展
• 2. H5N1禽流感病毒抗原特性分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 抗体
• 2.2.1.2 细胞及鸡胚
• 2.2.1.3 病毒
• 2.2.1.4 菌株和质粒
• 2.2.1.5 引物
• 2.2.1.6 主要试剂及其配制
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 Western-blot
• 2.2.2.2 间接免疫荧光检测
• 2.2.2.3 病毒的增殖及收集
• 2.2.2.4 1%鸡红细胞悬液和4单位抗原的制备
• 2.2.2.5 血凝试验及血凝抑制试验
• 2.2.2.6 细胞培养
• 50测定'>2.2.2.7 病毒TCID₅₀测定
• 2.2.2.8 中和实验
• 2.2.2.9 RNA抽提的试剂和器材的DEPC处理
• 2.2.2.10 病毒RNA的提取
• 2.2.2.11 RT-PCR及PCR
• 2.2.2.12 PCR产物回收
• 2.2.2.13 连接反应
• 2.2.2.14 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2.15 连接产物的转化
• 2.2.2.16 HA重组质粒的PCR鉴定
• 2.2.2.17 序列测定和比对
• 2.2.2.18 HA晶体模型上氨基酸突变位点分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 单抗活性
• 2.3.2 间接免疫荧光检测结果
• 2.3.3 血凝试验结果
• 2.3.4 单抗对10株病毒的HI效价
• 50的测定'>2.3.5 TCID₅₀的测定
• 2.3.6 单抗对10株病毒的中和效价
• 2.3.7 HA基因PCR结果
• 2.3.8 HA重组质粒的PCR鉴定结果
• 2.3.9 HA基因序列比对结果
• 2.3.10 HA基因遗传进化分析
• 2.3.11 病毒HA蛋白突变位点分析
• 2.3.12 HA晶体结构上的氨基酸突变位点
• 2.4 讨论
• 3. 流感病毒混合感染对小鼠的致病性分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 病毒
• 3.2.1.2 小鼠
• 3.2.2 方法
• 50测定'>3.2.2.1 病毒TCID₅₀测定
• 3.2.2.2 混合感染小鼠动物模型的致病性评价
• 3.2.2.3 混合感染小鼠病理变化及肺脏炎性因子含量的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 感染小鼠的存活率
• 3.3.2 感染小鼠的死亡率和MDT规律
• 3.3.3 感染小鼠的体重变化规律
• 3.3.4 感染小鼠的临床症状和病理变化
• 3.3.5 混合感染小鼠肺脏炎性因子含量
• 3.4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录