贵州部分玉米杂交种及其亲本指纹图谱的构建与相关分析

论文摘要

本研究利用SSR分子标记技术,对我国贵州目前生产上正在使用或已（待）审定即将推广应用的杂交玉米品种48份及其亲本81份共计129份材料进行研究,建立了一套简便、快捷、准确可靠的SSR分子标记技术鉴定体系,构建了贵州部分玉米自交系及杂交组合的指纹图谱,探索了多重PCR技术体系。其主要研究结果如下:1.从玉米基因组DNA提取、PER反应体系、PCR扩增程序、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染5个方面,进行比较分析,建立了如下快速简便的玉米SSR分子标记技术操作规程:（1）宜以SDS法或CTAB法提取玉米DNA样品。（2）SSR反应体系宜为:1U Taq酶,1x bufer,60μg模板DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.15mmol/L dNTPs,0.3μmol/L引物。（3）扩增程序宜为:预变性:93℃,1min变性:93℃,1mim退火:60℃,2min;延伸:72℃,2min;2～4步骤:30个循环:延伸:72℃,5min。（4）宜用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶或6%变性聚丙烯酰胺凝胶分离SSR扩增产物。（5）银染法:蒸馏水洗2次;0.2%硝酸银染色10min:蒸馏水洗2次;（3%氢氧化钠+0.5%甲醛）溶液显色。经验证,用该技术规程进行玉米SSR标记分析能获得经济有效的效果,利用SSR分子标记技术进行玉米指纹图谱的构建是可行的。2.根据北京市农林科学院筛选出的100对玉米SSR核心引物,从每条染色体上选取2对,分别位于染色体的长臂和短臂上,共20对核心引物,建立了玉米杂交种及其亲本的DNA指纹图谱。根据分析,实际上只用10对引物就可以把129份供试玉米材料区分开。因此,本研究用20对SSR引物构建的指纹库,可以扩展应用范围,即再增加一些材料,也可用该指纹库进行识别。3.用于构建贵州近些年审定的杂交种及其亲本自交系指纹图谱的20对SSR引物,多态性丰富,扩增产物一般有4-7条带,每条带分子量在100-400bp范围;平均每个位点检测到等位基因数为5.3个,多态信息量为0.611,标记索引系数为3.34。利用这20对SSR引物构建的DNA指纹库,可用于玉米杂交种和自交系的真实性鉴定。4.应用上述优化的SSR技术操作程序,在20对SSR引物中,进行任意两两组合的两重PCR试验,筛选较好的两重PCR组合,增加一对引物,进行三重PCR组合试验。筛选较好的三重PCR组合,而后逐个增加引物,达到6对引物组合的多重PCR,多重PCR扩增结果与分别进行的单一引物扩增结果一样。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 1.1 农作物品种鉴定的发展
• 1.2 品种鉴定的原理和依据
• 1.3 常规品种鉴定的方法及其特点
• 1.3.1 品种形态鉴定
• 1.3.1.1 种子形态鉴定法
• 1.3.1.2 幼苗形态鉴定法
• 1.3.1.3 植株形态鉴定法
• 1.3.2 细胞遗传学鉴定
• 1.3.3 解剖鉴定法
• 1.3.4 物理鉴定法
• 1.3.5 生理鉴定法
• 1.3.6 化学鉴定法
• 1.3.7 生物化学鉴定法
• 1.3.7.1 同工酶
• 1.3.7.2 种子贮藏蛋白
• 1.3.7.3 单克隆抗体
• 1.3.8 组合鉴定法
• 1.4 计算机模拟形态分析技术
• 1.5 DNA指纹图谱技术
• 1.5.1 DNA指纹技术发展简况
• 1.5.2 DNA指纹技术特点
• 1.5.3 常用DNA指纹技术的原理及其优缺点
• 1.5.3.1 RFLP指纹图谱
• 1.5.3.2 RAPD指纹图谱
• 1.5.3.3 AFLP指纹图谱
• 1.5.3.4 SSR指纹图谱
• 1.5.3.5 SCAR技术
• 1.5.3.6 其他
• 1.5.4 DNA指纹技术在农作物品种鉴定上的应用
• 1.5.4.1 分析、检验品种的真实性及纯度
• 1.5.4.2 绘制新品种指纹图谱,保护品种权
• 1.5.4.3 品种的亲缘关系和分类研究
• 1.5.4.4 新品种的DUS测试
• 1.5.4.5 区试试验品种质量监控
• 1.5.5 存在问题及展望
• 1.6 本课题研究的主要内容
• 1.7 本研究的目的与意义
• 第二部分 玉米SSR分子标记技术操作规程的优化
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 SSR引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA的提取
• 2.2.2 SSR扩增反应体系
• 2.2.3 不同浓度的非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.4 四种常用的银染方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 三种方法提取的DNA样品的SSR检测结果
• 2.3.2 SSR反应体系的优化
• 2.3.3 SSR-PCR扩增程序的优化
• 2.3.4 PCR产物检测方法的优化
• 2.3.5 体系稳定性鉴定
• 2.3.6 优化结果在其他作物上的应用
• 2.4 结论与讨论
• 2.4.1 玉米基因组DNA提取
• 2.4.2 SSR反应体系
• 2.4.3 SSR扩增程序
• 2.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.4.5 本试验优化结果在其他作物上的应用
• 第三部分 贵州部分玉米杂交种及其亲本指纹图谱的构建
• 3.1 试验材料
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 SSR引物
• 3.2.2 DNA的提取与检测
• 3.2.3 SSR反应
• 3.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
• 3.2.5 数据统计方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 SSR标记检测结果
• 3.3.2 玉米自交系的鉴别
• 3.3.3 玉米杂交种鉴别
• 3.3.4 玉米杂交种及其亲本的指纹图谱
• 3.3.5 本指纹库的扩展
• 3.3.6 玉米品种的DNA指纹图谱的符合性检验
• 3.4 讨论
• 3.4.1 玉米品种的DNA指纹
• 3.4.2 玉米品种DNA指纹的带型
• 3.4.3 SSR引物多态性及其特异性
• 3.4.4 SSR核心引物确定的作用
• 3.4.5 指纹库准确性
• 第四部分 多重PCR技术探索
• 4.1 供试材料
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 基因组DNA提取
• 4.2.2 多重PCR引物组合
• 4.2.3 SSR反应体系
• 4.2.4 SSR扩增程序
• 4.2.5 聚丙烯凝胶电泳检测
• 4.2.6 数据统计方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 两重PCR扩增结果
• 4.3.2 三重PCR扩增结果
• 4.3.3 四重PCR扩增结果
• 4.3.4 五重PCR扩增结果
• 4.3.5 六重PCR扩增结果
• 4.4 讨论
• 第五部分 结论与讨论
• 5.1 玉米SSR分子标记技术操作规程的优化
• 5.2 贵州部分玉米杂交种及其亲本指纹图谱的构建
• 5.3 多重PCR技术探索
• 5.4 带型分析
• 5.5 本研究拟开展的后续工作
• 5.5.1 扩展已经建立的玉米SSR指纹数据库
• 5.5.2 SSR与田间检测指标相统一
• 5.2.3 SSR技术进一步完善
• 致谢
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 附录5
• 附录6