论文摘要
目的XPB 蛋白又名ERCC3 蛋白,是存在于几乎所有生物体细胞中的一种重要蛋白质,它即是真核细胞基本转录因子TFIIH 的最大亚基p89,又是核酸剪切修复（NER）途径中关键的功能基因。XPB 具有从3′端→5′端依赖ATP的单链DNA 解旋酶活性,执行依赖DNA 的ATP 酶和解旋酶功能,在细胞内损伤DNA 的修复和RNA 聚合酶II 指导的基因转录过程中均起重要作用。正是由于XPB 在基因转录和DNA 修复中的双重功能,使它参与了这两个完全不同的DNA 代谢过程,并将两者有机偶联,该基因在功能上被认为是核苷酸剪切修复基因和肿瘤抑制基因。乙型肝炎病毒感染肝细胞后,乙型肝炎病毒X蛋白HBx 影响了XPB 和p53 在mRNA 及蛋白水平的表达,HBx 与XPB、p53三者间有着直接和间接的作用关系。为了研究XPB 在慢性肝炎和肝细胞癌的发生、发展过程中的表达及其意义和作用机制,在本课题研究中,我们拟克隆人XPB 基因的全长编码序列cDNA,并将其正向单倍插入真核表达质粒pcDNA3.1（+）载体中,构建重组体pcDNA3.1（+）-XPB, 以期建立能稳定表达野生型XPB 基因的转基因肝癌细胞株,为研究、探讨此重组体转染后,细胞内相关基因的mRNA 和蛋白表达的变化规律,以及细胞的生物学特性变化提供研究手段,也进一步为肿瘤疾病尤其是肝细胞癌的基因治疗寻找分子靶点。方法1.用DMEM+10%FBS 培养基培养人HeLa 细胞,从HeLa 细胞中提取总RNA;2.采用RT-PCR 技术,自行设计PCR 引物扩增XPB 基因cDNA 全长编码序列CDS;3.用限制性核酸内切酶HindIII 和BamHI 分别双酶切质粒pcDNA3.1（+）和XPB cDNA 片段,电泳后分别回收并纯化两端带不同粘性末端的质粒pcDNA3.1（+）和XPB cDNA 片段;4.用T4DNA 连接酶连接双酶切后带有互补粘性末端的质粒pcDNA3.1（+）和XPB cDNA 片段;5.制备感受态细胞JM-109;6.将连接产物（重组体pcDNA3.1（+）-XPB）转化入感受态细胞JM-109,经抗生素氨苄青霉素筛选,挑阳性单菌落扩增,提取并纯化重组体