论文摘要
土拉菌病又称“野兔热”,是由土拉弗氏菌引起的一种自然疫源性疾病,呈世界性分布。该菌具有传播途径多样（可经患病野生动物、吸血昆虫或遭受污染的水、食物及空气传播）、感染剂量低、致病性强的特征,因此被列为与鼠疫、炭疽等同列的A类恐怖源。土拉弗氏菌在自然界的宿主主要包括节肢类和哺乳类动物,如:蜱类、野兔类、鼠类等。在中国,土拉弗氏菌最早于1957年从黄鼠体内分离得到的。1959年黑龙江省报道了第一起人间感染“野兔热”。随后证实西藏、新疆、甘肃等地也存在土拉菌病的自然疫源地,从上述地区“野兔热”患者、蜱、野兔及野鼠等体内均分离到了病原菌。自1986年,在山东某肉类加工厂爆发了人间“野兔热”后,有关“野兔热”的病例及自然状态下宿主动物感染土拉弗氏菌的相关研究在中国未见报道。目前尚不清楚是否以往自然疫源地已经消失或处于静止,还是由于没有报道?此外,该病许多流行病学特征如媒介及宿主动物感染情况、疫源地变化情况、基因型别差异等目前仍不清楚;同时目前在我国尚缺乏快速简便的病原体甄别技术,这使得在疾病发生时,对病原体的来源追踪及准确判断疾病是自然发生还在认为人为施放无法实现。针对上述问题,本研究首先对我国北方部分地区（新疆、内蒙古、黑龙江、吉林）及两个南方省区（福建、浙江）进行了分子流行病学调查研究。利用巢式PCR的方法,对来自调查点的蜱标本及野鼠标本进行检测,然后利用亚种鉴别引物对阳性标本进行亚种确定,同时随机选取标本进行测序加以验证。结果显示,蜱的感染率为1.98% （33/1670）,其中全沟硬蜱和草原革蜱为主要的媒介;野鼠的感染率为4.76% （20/420）,其中在检测的14个鼠种中,共有7个鼠种感染,尽管花鼠和大仓鼠具有最高的阳性率,但未发现鼠种间感染率的差异。亚种鉴别显示:所有感染均为土拉弗氏菌B亚种。在研究中的南方两个省区标本中未发现媒介及宿主动物感染土拉弗氏菌的证据。同时,在实验室建立起目前公认的3种分析方法即AFLP、PFGE和MLVA分析方法,并对上述方法逐一进行分析与评价。AFLP的研究结果显示:45对引物组合中,3对选择性引物能将西藏的2株分离株与其他分离株鉴别出来,但对其他菌株显得无能为力,同时在测序中发现,在土拉弗氏菌基因组中存在重复序列,因此AFLP法并不适用于土拉弗氏菌的快速鉴别。PFGE研究显示:在使用的7种内切酶中,BamHI和XhoI具有较好的鉴别效果。XhoI酶切后产生大约20条不同大小的条带,大小在20～100 kb之间,受试菌株条带数目一致,片段分布一致。BamHI酶切后,可产生大约15条DNA片段,其范围从27～330 kb,酶切后片段存在差别,产生的条带数目和大小均有所区别,能将同一地区来源的菌株相互区别开来。MLVA法研究显示:在运用的25个位点中,重复位点片段从2 bp—23 bp。其中Ft-M3位点是一9 bp的重复单元,有5种不同的序列组合,中国菌株序列组合为9A及9E两种。菌株在此位点存在7种不同的基因型,此位点虽然存在不同的序列组合,但其并不影响氨基酸的排列。在M-4,20,21,22,24位点存在2-3种不同的基因型,其余位点均只有一种基因型;Ft-M5及Ft-M7-10代表的是5个16 bp的重复单元,这5个重复单元位于土拉弗氏菌插入子单元中,虽然在已报道的研究中显示这5个位点的多态性程度很高,但在本研究中,在中国菌株中并未显示出这一特点,所有实验菌株均具有相同的片段大小及拷贝数。Ft-M19位点的重复序列位于30- bp的缺失位置,在土拉弗氏菌B亚种的菌株中表现为缺失,因此也常用来鉴别A、B亚种。分别计算25个位点的多样性指数,其中以Ft-M3的多样性指数最高,达到0.91,Ft-M4位点为0.50, Ft-M6为0.62, Ft-M20为0.35, Ft-M21为0.44, Ft-M22为0.34, Ft-M24为0.52。而其他位点在中国菌株中不具有多样性,但需注意的是Ft-M1及Ft-M25这两个位点,我国菌株在这两个位点存在19和7这种类型,而报道的均为3和5。分析其基因序列发现,两位点拷贝数的差异已经影响到的氨基酸的排列,此种改变能否造成菌株在致病性及毒力等方面的改变无法得知。利用已经建立起来的MLVA法,对中国不同来源的分离株和阳性标本进行基因分型研究。不同来源的分离株分析显示:利用25个位点的基因序列分析,可将菌株分为个不同5个群,即新疆群、西藏群、内蒙群、黑龙江群及疫苗株群,而这与该病在我国疫源地的分布情况基本一致。5个群中以西藏群为基础,新疆群为主干,由此产生疫苗株群、内蒙群和黑龙江群。同时以菌株不同位点的拷贝数为基础,转化为距离距阵,利用距离距阵构建系统发育数,分析菌株间的相互关系,结果将菌株分为2个大群即新疆群和西藏群。而黑龙江、内蒙的分离株处在西藏群中,而疫苗株处于新疆群中。上述结果与序列分析的结果一致。利用A亚种及B亚种代表株及来自瑞典、日本、美国等国家菌株的MLVA数据综合比较发现,我国大部分菌株与瑞典的分离株较为接近,但部分菌株与A亚种菌株接近,值得注意的是在我国菌株中存在与日本分离株相近的菌株,而越来越多的研究显示:日本分离株与已知的土拉弗氏菌4个亚种差别较大,甚至有学者提出日本分离株应代表新的一个亚种。利用6个具有多样性的MLVA位点,对检测阳性的标本进行基因型别分析发现一种在蜱标本中普遍存在的基因型别,综合分析发现标本中土拉弗氏菌的基因型别存在物种的差别,但未发现地域特异性的特点。对我国北方部分地区进行了土拉弗氏菌的分子流行病学调查研究,发现以往的疫源地并没有静止或消失,确定了土拉弗氏菌在我国的主要媒介为全沟硬蜱及草原革蜱;建立了以PFGE和MLVA为基础的我国土拉弗氏菌鉴别方法,确定了以MLVA为基础的中国菌株快速甄别的方法;利用建立的MLVA了解了我国土拉弗氏菌的基因型别特征及与国外菌株间的关系;同时通过本研究,建立了与国际土拉弗氏菌知名实验室相互合作的关系。
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