猫泛白细胞减少症病毒XJ株的分离及生物学特性研究

论文摘要

本试验从新疆病死猫肠内容物中分离得到病毒。通过猫肾传代细胞（CRFK）传代,测定第3代细胞培养物病毒细胞半数感染量（TCID50）为104.21;电镜下可观察到呈聚集状态的无囊膜病毒粒子,具有典型细小病毒形态,病毒以实心和空心两种病毒粒子形态存在;细胞培养物与FPLV单克隆抗体能够特异性结合,可见特异性荧光;将培养的病毒接种易感动物,感染幼猫4d出现临床症状,7d内全部发病死亡,剖检有明显FPLV感染特征。在发病猫空肠中PCR扩增出FPLV VP2基因条带。以上试验结果表明,分离的病毒为猫泛白细胞减少症病毒,命名为FPLV-XJ株。FPLV-XJ株仅在4℃条件下凝集猪红细胞,凝集效价为512;而对其他动物的红细胞不凝集,且FPLV-XJ对猪红细胞的凝集作用可被FPLV单克隆抗体所抑制。FPLV-XJ对犬肾传代细胞（MDCK）、人子宫癌细胞（Hela）、恒河猴肾细胞（Vero）、鸡胚成纤维细胞（DF-1）、猪肾传代细胞（PK-15）不形成CPE;其中在MDCK细胞第14代培养物中可以检测到病毒核酸,在其他细胞培养物中无病毒核酸检出。间接免疫荧光监测病毒在细胞内的增殖情况,结果表明FPLV-XJ适合同步接毒,接毒后第4d5d病毒在细胞内复制达到高峰,第6d病毒由细胞中释放。对XJ株VP2和NS1基因进行扩增、序列测定与分析。结果表明:FPLV-XJ株的VP2基因长1755bp,编码584个氨基酸,与GenBank中5株FPLV和4株CPV核苷酸序列同源性达99%以上,氨基酸序列同源性介于98.5%99.7%。系统发育进化树表明,分离的FPLV-XJ株的VP2基因与GenBank中FPLV同在一个分支;NS1基因长2007bp,编码668个氨基酸,与GenBank中登录的6株FPLV和5株CPV NS1基因核苷酸及推导的氨基酸序列比较,同源性分别在98.7%99.3%和98.5%99.3%,FPLV-XJ株的核苷酸和氨基酸同源性与CPV毒株更接近,系统发育进化树表明,FPLV-XJ株NS1基因与CPV-b亲缘关系密切,但FPLV-XJ株NS1基因在FPLV和CPV群外形成单独的分支,说明FPLV-XJ株NS1基因有进一步产生新变异的可能性。依据上述试验结果,推测FPLV-XJ株处于FPLV向CPV变异的过渡阶段。本试验分离了新疆地区FPLV-XJ毒株,并从形态学、血清学、组织病理学、分子生物学等方面对FPLV-XJ株的生物学特性进行系统研究。不仅为FPLV的病原特征、致病机理及流行病学调查提供宝贵的资料,还为FPLV和CPV之间的演化研究提供依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 猫泛白细胞减少症研究进展
• 1.1.1 病原
• 1.1.2 致病机理
• 1.1.3 流行病学
• 1.1.4 临床特征
• 1.1.5 诊断方法
• 1.2 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 病料与细胞
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 菌株与载体
• 2.1.4 单克隆抗体与荧光抗体
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 培养基及溶液的配制
• 2.1.7 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 病毒分离
• 2.2.2 电镜观察
• 2.2.3 间接免疫荧光
• 2.2.4 动物接种
• 2.2.5 红细胞凝集特性
• 2.2.6 细胞感染谱
• 2.2.7 病毒生长特性
• 2.2.8 VP2 基因扩增与序列测定
• 2.2.9 NS1 基因扩增与序列测定
• 3 试验结果
• 3.1 病毒分离
• 3.2 电镜观察
• 3.3 间接免疫荧光
• 3.4 动物接种
• 3.4.1 临床及剖检变化
• 3.4.2 PCR 鉴定
• 3.4.3 病理组织学变化
• 3.5 红细胞凝集特性
• 3.6 细胞感染谱
• 3.7 病毒生长特性
• 3.8 VP2 基因的扩增及序列测定
• 3.8.1 VP2 基因的扩增
• 3.8.2 VP2 重组质粒酶切鉴定
• 3.8.3 VP2 基因序列测定
• 3.9 NS1 基因的扩增及序列测定
• 3.9.1 NS1 基因的PCR 扩增
• 3.9.2 NS1 重组质粒酶切鉴定
• 3.9.3 NS1 基因序列测定
• 4 讨论
• 4.1 FPLV-XJ 株生物学特性
• 4.2 FPLV-XJ 株分子生物学特性
• 4.2.1 VP2 基因分析
• 4.2.2 NS1 基因分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文