体外SELEX技术筛选灭活铜绿假单胞菌适体的研究及初步应用

论文摘要

【目的】利用指数富集配基的系统进化（SELEX）技术,以灭活的铜绿假单胞菌作为复合靶分子,从体外合成的96个nt的随机寡核苷酸文库中筛选出与铜绿假单胞菌高亲和力高特异性的适体,并建立荧光基团标记适体快速鉴定铜绿假单胞菌的检测方法。【方法】1.在体外构建两端为固定序列,中间为60个nt的随机序列,全长96个nt的寡核苷酸文库,以灭活的铜绿假单胞菌为靶标,经SELEX筛选,筛选出针对铜绿假单胞菌高亲和力高特异性的适体,用酶连接适体直接检测法（Enzyme-linked aptamer direct assay,ELADA）利用地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统进行ssDNA富集库与铜绿假单胞菌的结合测定。2.我们在实验中从第12轮和第14轮分别同时进行ssDNA文库与嗜麦芽窄食单胞菌和鲍曼不动杆菌反筛和未反筛的两条思路,运用ELADA间接比较反筛和未反筛获得的ssDNA富集库与铜绿假单胞菌的结合力。3.将第6轮、第10轮和第15轮筛选产物分别进行扩增、纯化, TA克隆、测序并用相关软件分析其一级和二级结构。4.用ELADA进行克隆适体与铜绿假单胞菌的结合测定,选出OD值明显高的3个克隆适体,并对其进行亲和力测定;然后对亲和力最高的克隆适体,进一步进行灵敏度和特异性分析。运用DFA（dot filtration assay, DFA）对F23克隆适体与非发酵菌进行特异性检测。5.建立荧光基团标记适体快速鉴定铜绿假单胞菌检测方法:将F23适体进行5’-FAM和5’-TAMRA荧光基团标记直接和非发酵菌结合、洗涤、封片,荧光显微镜检查。【结果】1.随着筛选轮数的增加,铜绿假单胞菌与ssDNA富集库结合的OD值逐渐增加,第十二轮反筛选获得的富集库与铜绿假单胞菌结合后显色的OD值（0.448）是第一轮OD值（0.022）的23倍。当ssDNA富集库与铜绿假单胞菌上的结合位点达到一个饱和状态时,吸附到铜绿假单胞菌上的ssDNA就不再增加。2.经过反筛和未反筛的ssDNA富集库与铜绿假单胞菌结合的OD值有显著差异,从最低的第15轮的反筛和未反筛的OD比值为1.3倍,到最高的第14轮比值的53倍。3.克隆序列结果发现第6轮、第10轮和第15轮未反筛的序列均无富集,而第15轮反筛的克隆子进行测序,发现24个预期随机序列中有2条序列富集,几乎完全一致（F23和F47）,同源性达97%,利用ClustalX和Mega2软件分析序列的一级结构的同源性和分类,分成10个家族（Family）,利用Mfold sever软件模拟二级结构。4.克隆适体F17、F23和F47与铜绿假单胞菌结合的OD值明显增高;进行亲和力测定,可知:F23的Kd为14.55nM,F47为77.46nM,F17为493.3nM;克隆适体F23灵敏度的结合测定,细菌数可低至2×106;通过ELADA和DFA法检测F23与非发酵菌特异性结合,发现依次为铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌,这两个方法的检测结果是一致。5.通过荧光基团5’-FAM和5’-TAMRA标记克隆适体F23对非发酵菌进行荧光直接检测,结果发现F23与铜绿假单胞菌结合的荧光强度明显比其它菌强,尤其5’-TAMRA标记适体更能够减少组织自发性荧光的非特异性背景的干扰。【结论】本研究运用指数富集配基的系统进化（SELEX）技术,利用其他非发酵菌进行反筛,经十五轮筛选出针对灭活铜绿假单胞菌的ssDNA适体,在国内外首次运用ELADA和DFA对筛选出的适体进行亲和力、灵敏度和特异性的分析,已成功筛选到高亲和力高特异性的针对灭活铜绿假单胞菌的适体,并在国内首次建立荧光基团标记适体快速鉴定铜绿假单胞菌检测方法,为铜绿假单胞菌临床快速鉴定带来了希望。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究内容
• 引言
• 第一部分 SELEX技术筛选灭活铜绿假单胞菌适体方法的建立
• 一. 材料和方法
• 二. 结果
• 三. 讨论
• 四. 小结
• 第二部分 适体的克隆、测序
• 一. 材料和方法
• 三. 讨论
• 四. 小结
• 第三部分 铜绿假单胞菌适体的鉴定和分析
• 一. 材料和方法
• 二. 结果
• 三. 讨论
• 四. 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 参考文献