论文题目: TGF-β1/Smads信号转导途径在肺肌成纤维细胞分化中的作用及IFN-γ、地塞米松的影响
论文类型: 博士论文
论文专业: 内科呼吸病学
作者: 谷丽
导师: 朱元珏,许文兵
关键词: 成纤维细胞,肌成纤维细胞,转化生长因子,平滑肌骨动蛋白,蛋白,博莱霉素,肺纤维化,干抚素,地塞米松
文献来源: 中国协和医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 一、Smads蛋白在TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中作用 目的：肺肌成纤维细胞在肺纤维化发生机制中起重要作用，其分化标志是α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表达。研究发现TGF-β1可通过Smads蛋白家族成员传递信号发挥生物作用，因此本研究主要探讨在TGF-β1诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化过程中，各Smad蛋白对α-SMA基因表达的调控作用。 方法： 1、体外培养人胚胎肺成纤维细胞（HFL-F），TGF-β1干预后通过Western blot及RT-PCR分析α-SMA基因mRNA和蛋白水平表达的变化，同时用免疫荧光法观察细胞形态改变。 2、构建含人α-SMA基因启动子序列的荧光素酶报告基因质粒（p895-Luc）和Smad2突变表达质粒(pSmad2mut)：以人基因组DNA为模板用PCR扩增人α-SMA基因启动子-895～+9bp序列，插入到pGal3-basic质粒的MluⅠ和XhoⅠ酶切位点之间形成p895-Luc。突变Smad2序列是通过以pCS2-Smad2质粒为模板用PCR方法获取，然后将其插入到经BglⅡ和XhoⅠ酶切后的pCS2-Smad2质粒片段形成pCS2-Smad2mut。Smad2、Smad3、Smad7和Smad3mut表达质粒为他人惠赠。 3、用Fugene6.0将p895-Luc分别和各种Smad表达质粒瞬时共转染至HFL-F中，TGF-β1干预后测定其荧光素酶和β—半乳糖苷酶的活性。 4、用Fugene6.0将各种Smad表达质粒瞬时转染至HFL-F中，TGF-β1干预后通过Western blot分析α-SMA基因的蛋白表达。 结果： 1、5ng／ml TGF-β1作用4天能诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。 2、过表达Smad3能增强TGF-β1诱导的α-SMA基因启动子活性和其蛋白表达，而过表达Smad3mut能抑制这种增强作用，但没有使其恢复到基础水平，两者对α-SMA基因的基础表达没有影响。 3、过表达Smad2和Smad2mut不影响TGF-β1对α-SMA基因启动子活性及蛋白表达的
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一部分 Smads蛋白在TGF-β_1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中的作用
前言
实验材料
一、细菌菌株及质粒载体
二、质粒构建所需的酶以及其它试剂
三、PCR扩增引物
四、细胞系及细胞培养
五、细胞因子其他试剂及试剂盒
六、主要仪器
实验方法
一、TGF-β_1在体外诱导肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞分化
二、含人a-SMA基因启动子序列的荧光素酶报告基因质粒的构建与鉴定
三、pCS_2-Smad2~(mut)表达质粒的构建与鉴定
四、Smads蛋白在TGF-β_1诱导人a-SMA基因启动子活性的影响
五、Smads蛋白在TGF-β_1诱导人a-SMA基因蛋白表达的影响
六、统计学处理
结果
一、TGF-β_1能在体外诱导肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞分化
二、质粒的酶切和测序鉴定
1、含人a-SMA基因启动子序列的荧光素酶报告基因质粒p895-Luc的成功构建
2、pCS_2-Smad2~(mut)表达质粒的成功构建
3、其它质粒的鉴定
三、p895-Luc荧光素酶活性的检测
四、Smads在TGF-β_1诱导人a-SMA基因表达的作用
1、Smad3在TGF-β-1诱导人a-SMA基因表达的作用
2、Smad2在TGF-β_1诱导人a-SMA基因表达的作用
3、Smad7在TGF-β_1诱导人a-SMA基因表达的作用
讨论
小结
参考文献
第二部分 Smad3对博莱霉素诱导肺维化模型中肌成纤维细胞分化的作用
前言
实验材料
一、实验动物
二、主要仪器和试剂
实验方法
一、博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型的制作
二、动物分组
三、观察项目
四、动物处理
五、检测指标
1、肺组织羟脯氨酸含量的测定
2、肺组织切片染色
3、Western blot定量分析肺组织α-SMA的表达
六、统计学处理
结果
一、动物的一般情况
二、肺组织的病理学改变
三、肺组织羟脯氨酸含量变化
四、肺组织α-SMA的蛋白表达
讨论
小结
参考文献
第三部分 干扰素-γ、地塞米松对TGF-β_1诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响
前言
实验材料
一、细胞系及细胞培养
二、主要仪器和试剂
实验方法
一、Western blot
二、细胞免疫荧光法
三、细胞免疫化学法
四、羟脯氨酸的测定
五、RT-PCR检测胶原Ⅰ和Ⅲ mRNA的表达
六、统计学处理
结果
一、IFN-γ和DEX对α-SMA表达的影响
二、IFN-γ和DEX对细胞形态的影响
三、IFN-γ和Dex对胶原合成的影响
四、IFN-γ对TGF-β_1／Smads信号途径的影响
1、IFN-γ不影响Smad2／3和Smad7内源行性表达
2、IFN-γ不抑制Smad2／3磷酸化和细胞核转位
讨论
小结
参考文献
综述一
综述二
附录1 主要溶液的配制
附录2 缩略语表
致谢
发布时间: 2006-10-13
参考文献
- [1].肺纤维化过程中肌成纤维细胞活化的调控机制及干预研究[D]. 梁敏锐.复旦大学2013
- [2].酪氨酸激酶受体DDR2信号在小鼠肺纤维化模型中的作用及干预研究[D]. 赵虎.第四军医大学2015
- [3].特发性肺纤维化发病机制研究[D]. 张稷.苏州大学2013
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