论文题目: 猪附红细胞体分子诊断与致病机理的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 临床兽医学
作者: 贾杏林
导师: 齐长明,沈志强
关键词: 猪附红细胞体,分子生物学诊断,流式细胞术,细胞凋亡,病程,发病原因,传播途径
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本文重点对猪附红细胞体的分子诊断、猪附红细胞体病的发病原因、动物模型及新的传播途径和发病机理进行了初步研究,研究主要包括以下几个方面: 1.猪附红细胞体的分子诊断研究:参照国外分子生物学诊断E.suis的文献合成引物,从患病猪和临床健康猪的血液中提取病原DNA,进行PCR扩增,扩增出781bp的片段,该片段经过克隆、双酶切鉴定和测序及序列比较,与国外E.suis同源性为99.4%,与Gene bank中其它已知序列无同源性,用同样的条件从巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌、羊鞭虫、牛巴贝斯焦虫、弓形体、沙门氏菌、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒基因组及SPF猪血中未扩增出相同的序列。进一步对山东省3个有猪附红细胞体病临床症状的患病猪场和5个临床健康猪场各取5份猪血进行了血涂片染色镜检和PCR诊断,结果吻合,该试验从分子生物学水平表明我国存在着E.suis,与国外报道为同一病原,且在山东省的存在非常普遍。 2.猪附红细胞体解离诊断方法的研究:加入解离液(EPJL-1)前,血涂片用姬姆萨染色后置400倍光镜下观察,被猪附红细胞体寄生的红细胞变形,E.suis在红细胞周围染成紫红色小点。加入解离液(EPJL-1)后作用0.5-1min,红细胞恢复原来的形态,周围看不到紫红色小点。用该方法检测了10份PCR和涂片镜检阳性血清和一份阴性血清,结果符合。 3.猪附红细胞体病动物模型及新的传播途径的研究:豚鼠分为对照、攻毒组、隔离组和接触组4组,每组各4只。小白鼠分为对照、攻毒组、隔离组和接触组4组,每组各6只。攻毒后观察发病情况,结果攻毒组豚鼠、隔离组豚鼠和接触组豚鼠发病死亡,诊断为E.suis致病,对照组豚鼠和小白鼠均正常。初步表明豚鼠可作为该病的动物模型,初步认为空气和接触可以传播该病。 4.猪附红细胞体病病理学研究:取猪附红细胞体病患病猪和感染发病死亡豚鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、肠固定,制作病理切片,H.E染色,显微镜观察心、肝、脾、肺、肾出现出血和溶血性变化,胃、肠出现水肿和细胞坏死。 5.猪附红细胞体病典型病例的疗程观察及血液学研究:猪附红细胞体病病猪出现高热、红皮等前期症状,白细胞增多;中后期皮肤发白,腹下和四肢皮肤发绀,白细胞减少,出现溶血性贫血,有急性死亡的情况,病程约10天左右,热型为稽留热。 6.猪附红细胞体病发病原因初探:通过研究表明猪附红细胞体是一种典型的条件致病性微生物,低温、去势、不合格的疫苗注射和长途运输都可诱发猪附红细胞体携带猪发生该病。并在冬天进行了塑料大棚保温防制猪附红细胞体病的探索,效果较好。该研究初步解释了我国近几年猪附红细胞体病爆发及冬天无血源性传播媒介但发生该病的原因。 7.猪附红细胞体引起淋巴细胞凋亡的研究:取猪附红细胞体病自然发病猪14头及临床健康猪5头猪血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳,发病猪血淋巴细胞出现细胞凋亡特异性的DNA Ladder,而临床健康猪淋巴细胞未出现DNA Ladder;同时淋巴细胞用乙醇固定后用流式细胞仪检测,发病猪淋巴细胞出现细胞凋亡峰,而临床健康猪淋巴细胞未出现细胞凋亡峰,初步表明该病原可以引起发病猪淋巴细胞出现细胞凋亡。提出E.suis病原引起淋巴细胞凋亡导致免疫抑制的假说。
论文目录:
摘要
Abstract
英文缩略语释义
立题分析和实验内容的设计
第一章 文献综述
1.附红细胞体病的起源与发现
2.附红细胞体病的分布和危害
3.附红细胞体的分类和培养特性
4.附红细胞体的传播途径及病因学
5.猪附红细胞体的分子生物学和分子诊断
6.猪附红细胞体病的临床症状
7.猪附红细胞体病引起的病理变化
8.猪附红细胞体病的致病机理
9.猪附红细胞体病的诊断方法
10.猪附红细胞体病的防治
第二章 猪附红细胞体形态学诊断方法的研究
1.实验材料
2.实验方法
2.1 涂片染色镜检诊断方法
2.2 直接血液压片镜检
2.3 病原快速解离诊断方法的研究
3.实验结果
3.1 解离后红细胞变化
3.2 平行试验
4.讨论
第三章 猪附红细胞体分子诊断的研究
1.实验材料
1.1 实验猪血
1.2 对照细菌
1.3 菌种与质粒
1.4 试剂
1.5 试验用溶液及其配制
1.6 主要仪器设备
2.实验方法
2.1 猪附红细胞体DNA的制备
2.2 引物的设计与合成
2.3 PCR反应
2.4 PCR产物的纯化
2.5 PCR产物的回收
2.6 PE-DNA与pUC18-T载体的重组连接
2.7 重组连接后质粒DNA的转化
2.8 克隆的筛选
2.9 质粒DNA的小量制备-碱裂解法
2.10 重组质粒的酶切鉴定
2.11 阳性质粒的PCR鉴定
3.序列测定及分析
3.1 序列测定
3.2 序列分析
4.实验结果
4.1 猪附红细胞体诊断序列的扩增
4.2 猪附红细胞体诊断序列的克隆及重组质粒的鉴定
4.3 猪附红细胞体诊断序列的测序分析及分子诊断方法的特异性
4.4 PCR诊断方法与血液涂片染色结果比较
5.分析与讨论
6.小结
第四章 猪附红细胞体病病因学研究
1.低温诱发猪附红细胞体病临床病例的研究
1.1 实验材料
1.2 实验方法
1.3 试验结果
1.4 结论
1.5 讨论
2.长途运输诱发猪附红细胞体病典型病例的疗程观察及血液学研究
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.3 试验结果
2.4 结论
2.5 讨论
3.去势诱发猪附红细胞体病临床病例的研究
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.3 试验结果
3.4 结论
3.5 分析与讨论
4.疫苗注射诱发猪附红细胞体病临床病例的研究
4.1 实验材料
4.2 实验方法
4.3 实验结果
4.4 分析与讨论
第五章 猪附红细胞体病动物模型及传播途经的研究
1.实验材料
2.实验方法
2.1 实验前准备
2.2 实验设计
2.3 攻毒
2.4 豚鼠体温测定
2.5 称重
2.6 临床观察记录
2.7 血清学检测
2.8 病理变化研究
3.实验结果
3.1 各组豚鼠体重平均值变化
3.2 豚鼠临床记录
3.3 剖检变化及病理变化研究
3.4 各组豚鼠体温变化
3.5 豚鼠的存活和死亡情况
3.6 小白鼠的存活和死亡率情况
3.7 各组豚鼠血清抗体检测结果
3.8 豚鼠感染猪附红细胞体的检测
3.9 细菌培养结果
3.10 病料滤液接种细胞培养结果
3.11 几种主要病原的PCR诊断结果
4.分析与讨论
5.初步结论
第六章 猪附红细胞体病病理学研究
6.1 实验材料和仪器
6.2 病理组织切片的制作方法
6.3 实验结果
6.3.1 猪附红细胞体患病猪病理组织切片观察
6.3.2 感染豚鼠病理组织学观察
6.3.3 发病猪病理解剖学变化
6.3.4 感染豚鼠病理解剖学观察
6.4 分析与讨论
第七章 猪附红细胞体引起淋巴细胞凋亡的研究
1.实验材料
2.实验方法
3.试验结果
4.分析与假说
本研究的小结与创新点
参考文献
附图
致谢
作者简介
发布时间: 2005-07-18
参考文献
- [1].牛、猪附红细胞体病诊断方法的建立及粘附机制研究[D]. 宋淇淇.华中农业大学2014
- [2].猪附红细胞体吉林株单克隆抗体的制备应用和免疫蛋白组学研究[D]. 薛书江.延边大学2014
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- [8].广东省猪伪狂犬病流行病学调查和防控措施[D]. 陈平洁.南京农业大学2005
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- [10].副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[D]. 蔡旭旺.华中农业大学2006
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