氧化还原环境对肝癌细胞生长信号通路串话的调控作用研究

2020-12-06阅读(966)

论文摘要

正常的细胞生理代谢不可避免地产生活性氧分子（ROS）,过量的ROS具有化学毒性并对生物大分子产生氧化损伤,从而导致细胞功能的紊乱、病变甚至癌变。细胞通过各种酶系和生物抗氧化剂清除细胞内过多的ROS,调整细胞内的氧化还原状态;但另一方面,ROS又是细胞信号转导系统的组成部分,许多信号传递分子的功能因氧还状态的改变而受调控。肿瘤细胞与正常细胞相比,具有增殖失控和凋亡受抑等特点,在其中起调控作用的信号转导途径会发生某些特异性变化。本课题以HepG2肝癌细胞为主要研究对象,利用内、外源性抗氧化剂/酶及活性氧的介入调节细胞内氧化还原状态以及各种蛋白特异性抑制剂的作用,采用基因转染、RT-PCR、Western blot、流式细胞仪、荧光标记等技术研究了HepG2内ROS主要来源、GSH水平的变化和ROS介导HepG2细胞增殖、凋亡相关信号转导通路蛋白、基因表达、信号通路串话的调控作用。在预实验中采用电子传递链复合酶Ⅰ抑制剂鱼藤酮和NADPH氧化酶抑制剂DPI作用细胞,流式细胞仪和荧光成像等方法检测,表明HepG2细胞内的ROS主要来源于NADPH氧化酶,线粒体也是一个重要的源头;另一方面,对Chang细胞和HepG2细胞中及外源性干预HepG2氧还状态后GSH测定表明,HepG2细胞中的GSH比Chang细胞高,NADPH氧化酶抑制剂作用后,HepG2细胞的GSH水平升高,在这些过程中G6PD起着重要的作用;同时,预实验结果也表明,转染反义MnSOD cDNA和低浓度H2O2作用可以上调HepG2胞内的ROS,通过调节PI3K/Akt,MAPK相应蛋白的激活,促进转录因子AP-1,NF-κB mRNA的表达,从而调节HepG2细胞的增殖;转染正义MnSOD cDNA和抗氧化剂桑黄多糖干预则可以通过下调ROS而抑制HepG2的增殖。课题在预实验的基础上,主要利用各种信号通路的抑制剂干预和JNK基因转染细胞发现:低浓度的H2O2应激细胞,同时促进Akt、ERK、PKCζ的激活,而JNK只有在Akt受到抑制的条件下才被激活,引起PI3K/Akt和JNK信号通路串话,共同参与HepG2细胞的增殖过程,但ERK、PKCζ却不参与该信号通路串话;对不同ROS来源途径进行干预发现调控Akt和PKCζ表达的ROS主要来源于NADPH氧化酶,而调控JNK蛋白表达的ROS主要来源于线粒体;各种抑制剂单独或联合预处理细胞时对HepG2细胞的增殖和程序性死亡产生了不同的影响。20μM的LY294002与15μM的SP600125预处理细胞后HepG2细胞Akt与JNK的激活被完全阻断,但HepG2细胞没有被完全抑制生长。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章绪论

第一节文献综述

1.细胞内ROS的生成部位

1.1 呼吸链

1.2 内质网（ER）

1.3 NADPH氧化酶复合体

1.4 脂氧合酶系、环氧合酶系

2.活性氧的检测方法

2.1 化学发光法

2.2 荧光法

2.3 电子自旋共振法（ESR）

3.ROS对细胞信号通路的调控作用

3.1 ROS对细胞内氧化还原状态的调控

3.2 ROS对蛋白的氧化修饰

4.ROS对细胞代谢的调节作用

4.1 ROS调控细胞增殖

4.2 ROS调控细胞分化

4.3 ROS调控细胞凋亡

第二节课题依据与研究内容

1.课题依据

2.课题内容

参考文献

第二章课题预实验

第一节肝癌细胞活性氧的主要来源研究

材料和方法

结果

2^-和ROS'>1.流式细胞仪测定细胞中的·O₂^-和ROS

2.荧光图象

第二节肝癌细胞中GSH、GSSG的测定

材料和方法

结果

1.标准曲线

2.正常肝细胞Chang和肝癌细胞HepG2中GSH、GSSG及NADPH、NADP+的测定

3.DPI、白藜芦醇处理HepG2后GSH、GSSG的变化

第三节氧还环境对肝癌细胞生长及信号通路的影响

材料和方法

结果

1.MnSOD载体转染HepG2细胞鉴定

2.氧还环境对肝细胞ROS水平及生长的影响

3.氧还环境对肝细胞生长信号通路的影响

讨论

参考文献

第三章 HepG2细胞中PI3K/Akt和JNK串话的研究

材料和方法

结果

1.各种信号通路抑制剂对HepG细胞相关蛋白表达和mRNA表达的影

2.不同来源ROS阻断剂对蛋白表达的影响

3.不同抑制剂对HepG2细胞增殖的影响

3.1 LY294002对HepG2细胞生长的影响

3.2 SP600125对HepG2细胞生长的影响

3.3 PD98059对HepG2细胞生长的影响

3.4 LY294002与SP600125联合对HepG2细胞生长的影响

3.5 LY294002与PD98059联合对HepG2细胞生长的影响

4.各种抑制剂单独或联合作用对HepG2细胞程序性死亡的影响

讨论

参考文献

总结与展望

致谢

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标签：活性氧论文; 锰型超氧化物岐化酶论文; 谷胱甘肽论文; 蛋白激酶论文; 促分裂源激活蛋白激酶论文; 氧化酶论文;

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