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低氧诱导因子-1对肝细胞生长因子基因表达调控机制的研究

2020-11-23阅读(221)

低氧诱导因子-1对肝细胞生长因子基因表达调控机制的研究

论文摘要

目的：第一部分：（1） 观察氯化钴（CoCl2）及HIF-1α过表达对乳鼠心肌细胞及人宫颈癌Hela细胞存活及凋亡状况的影响。（2） 观察CoCl2模拟的低氧以及由pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒转染介导的HIF-1α过表达对乳鼠心肌细胞和Hela细胞中HGF／c-Met系统mRNA和蛋白表达的调节。（3）对人HGF基因启动子区进行生物信息学分析，寻找可能介导HGF低氧表达调控的转录因子作用位点。第二部分：根据生物信息学分析结果，在Hela和转染效率较高HEK293细胞中，研究HIF-1α对TGF-β2基因表达调控的作用机制，并进一步观察重组转化生长因子-β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）对Hela细胞中HGF表达的影响， 方法：第一部分：（1） 体外培养乳鼠原代心肌细胞和Hela细胞，应用MTT和流式细胞仪检测CoCl2对乳鼠心肌细胞和Hela细胞存活、增殖及凋亡的影响。（2） 构建pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒（3） 免疫印迹检测CoCl2和pcDNA3-HIF-1α质粒转染诱导的HIF-1α过表达后，Hela细胞中凋亡相关蛋白Bc1-2和Bax的表达。（4）RT-PCR检测100μmol／L CoCl2作用6～72h后，心肌细胞中HGF mRNA的表达。（5）Western Blot检测100gmol／L CoCl2作用心肌细胞12h后HIF-1α蛋白的表达。（6） 相对荧光实时定量PCR检测CoCl2和pcDNA3-HIF-1α质粒转染后，Hela细胞中HGF／c-Met mRNA的表达。（7） ELISA检测CoCl2对Hela细胞中分泌性HGF蛋白表达的影响。（8） 利用生物信息学分析人HGF基因启动子区可能的转录因子结合位点。第二部分：（1） 构建pGL3-EPO-HRE荧光素酶报告质粒和pGL3-TGF-β2及其五个突变体的荧光素酶报告质粒。（2） Western Blot和双荧光素酶报告基因法检测CoCl2和pcDNA3-HIF-1α质粒转染后，Hela和HEK293细胞中HIF-1α蛋白的表达量及其DNA结合活性。（3） 相对荧光实时定量PCR检测250μmol／L CoCl2单独作用Hela和HEK293细胞6h后，TGF-β2mRNA的表达，以及CoCl2处理和pcDNA3-HIF-1α质

论文目录

  • 目录
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一部分 低氧诱导因子-1α对肝细胞生长因子及其受体表达调节的研究
  • 前言
  • 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法
  • 实验结果
  • 1 细胞培养及鉴定
  • 2 pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒的构建
  • 2对心肌细胞及Hela细胞存活及增殖状态的影响'>3 CoCl2对心肌细胞及Hela细胞存活及增殖状态的影响
  • 2模拟低氧对乳鼠心肌细胞中HGF mRNA表达的影响'>4 CoCl2模拟低氧对乳鼠心肌细胞中HGF mRNA表达的影响
  • 2处理对Hela细胞中HGF／c-Met mRNA表达水平的影响'>5 HIF-1α真核表达质粒转染和CoCl2处理对Hela细胞中HGF／c-Met mRNA表达水平的影响
  • 2模拟的低氧对肿瘤细胞中HGF分泌蛋白表达的影响'>6 CoCl2模拟的低氧对肿瘤细胞中HGF分泌蛋白表达的影响
  • 7 人HGF基因启动子区转录因子结合位点分析
  • 讨论
  • 参考文献
  • 第二部分：低氧诱导因子-1α对转化生长因子-β2转录调节的研究
  • 前言
  • 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 2 实验方法
  • 实验结果
  • 1 质粒构建
  • 2 pcDNA3-HIF-1α质粒转染和CoCl2处理对HEK293和Hela细胞中HIF-1α蛋白表达量的影响
  • 3 HIF-1α过表达对HEK293和Hela细胞中pGL3-EPO-HRE报告基因活性的激活
  • 4 HIF-1α过表达对HEK293和Hela细胞中TGF-β2 mRNA表达水平的影响
  • 5 分析TGF-β2基因近侧启动子区的阳性HRE
  • 6 检测HIF-1在TGF-β2启动子区的阳性结合位点
  • 7 染色体免疫共沉降实验
  • 8 重组TGF-β2对肿瘤细胞中HGF分泌蛋白表达的影响
  • 讨论
  • 参考文献
  • 论文综述：肝细胞生长因子及其在疾病中的作用
  • 已发表综述1：转化生长因子-β与低氧
  • 已发表综述2：前列腺素与血管新生
  • 已发表论文：Down-regulation of hepatocyte growth factor mRNA in rat cardiac myocytes under hypoxia mimicked by Cobalt chloride
  • 已接收待发表论文1：pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒的构建及其在MCF-7细胞中的表达
  • 已接收待发表论文2：pGL3-EPO-HRE报告基因质粒的构建及功能鉴定
  • 待发表论文
  • 缩写词表
  • 个人简历
  • 致谢
  • 附图

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