红色毛癣菌蛋白质组学研究

论文摘要

红色毛癣菌（Trichophyton Rubrum）感染所致的浅部真菌病在世界各地广泛流行,红色毛癣菌感染难以治愈,且抗真菌药物停止治疗后频繁复发。本研究首次从整体水平对静止期红色毛癣菌分生孢子的蛋白质组进行全面的分析。本研究首先构建了红色毛癣菌8个时相的cDNA文库,建立了EST编码蛋白数据库。然后采用液氮研磨、蜗牛酶消化后样品预分级,同时结合多种酶消化,酶切后得到的肽片段混合物通过二维液相色谱分离,采用鸟枪法对蛋白进行鉴定。结果获得5304个不同的肽段序列,总计1026个蛋白得到鉴定。我们建立蜗牛酶消化破壁,结合样品预分级,然后胰酶和蛋白酶K进行酶解的蛋白提取分级分离方法,可以显著提高鉴定的蛋白数量。我们对所鉴定的1026个蛋白分别用NCBI non-redundant （NR）蛋白数据库, eukaryotic orthologous groups （KOG）数据库和gene ontology （GO）数据库进行检索,所鉴定的蛋白涵盖了所有主要的细胞器,如细胞核、线粒体、细胞膜、高尔基体、内质网,所鉴定的蛋白涉及到几乎所有的生物生化过程。本研究鉴定出红色毛癣菌分生孢子一些重要的蛋白,包括细胞壁结构蛋白、细胞壁生物合成相关蛋白,胞内蛋白质合成相关蛋白,静止期分生孢子代谢特征蛋白,信号传导蛋白以及环境压力耐受蛋白等等,并从蛋白分子水平上对其结构功能和机制进行了详细的讨论,红色毛癣菌分生孢子蛋白质组的分析结果证明了维持孢子的休眠状态是相当复杂和精细的过程,涉及到一系列的蛋白翻译、信号传导、环境压力耐受机制等,对将来真菌感染的预防、诊断,治疗和致病机制的研究有重要的提示作用。

论文目录

• 提要
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 红色毛癣菌的研究进展
• 1 浅表感染真菌致病特点和分类
• 2 红色毛癣菌的研究现状
• 第二章 蛋白质组学的研究进展
• 1 蛋白质组学的研究背景
• 2 蛋白质组学研究的范围
• 3 蛋白质组学的研究技术
• 4 基于质谱的蛋白质组学研究策略
• 5 定量蛋白质组学
• 6 蛋白质翻译后修饰
• 7 蛋白质-蛋白质相互作用
• 第三章 真菌蛋白质组学的研究进展
• 1 细胞破碎
• 2 蛋白质定量
• 3 蛋白质溶液的浓缩
• 4 双向电泳
• 5 质谱分析
• 第二篇 研究内容
• 第一章 红色毛癣菌EST文库的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 红色毛癣菌基因组 DNA 的提取
• 1.2.2 红色毛癣菌EST的获得
• 1.2.3 质粒提取与测序
• 1.2.4 生物信息学分析
• 2 结果
• 2.1 红色毛癣菌孢子及其他各时相菌体的培养和获得
• 2.2 总RNA 提取、mRNA 分离、纯化以及cDNA 文库的构建
• 2.3 ESTs 聚类和组装
• 2.4 红色毛癣菌EST 的分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 红色毛癣菌蛋白组分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 分生孢子培养
• 1.2.2 分生孢子胞浆蛋白提取方法的选择
• 1.2.3 细胞裂解和分级分离
• 1.2.4 样品消化
• 1.2.5 Oasis HLB固相萃取小柱脱盐操作
• 1.2.6 混合肽样品的多维蛋白鉴定（MudPIT方法）
• 1.2.7 串联质谱的数据分析
• 1.2.8 生物信息学分析
• 2 结果
• 2.1 分生孢子蛋白提取方法的分析
• 2.2 二维液相质谱的蛋白质组学方法鉴定结果
• 2.3 鉴定蛋白的生物信息学分析
• 3 讨论
• 3.1 红色毛癣菌分生孢子总蛋白的抽提策略
• 3.2 红色毛癣菌分生孢子蛋白的分离鉴定
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• Abstract
• 博士研究生期间发表论文情况
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介