犬瘟热病毒基因疫苗与重组犬腺病毒的构建及其实验免疫研究

论文摘要

犬瘟热（CD）是一种在世界范围内分布的对犬、毛皮经济动物乃至野生动物危害严重的急性、病毒性传染病。防治CD的有效途径是疫苗接种,虽然灭活疫苗和弱毒疫苗在控制CD发生上起了一定作用,但随着使用的广泛,也发现了许多缺陷,因此,必须寻找更安全、有效、实用的新型疫苗。基因疫苗和重组活载体疫苗是近年来研究比较热的新型疫苗,在预防免疫方面也取得很大进展。在CDV结构蛋白中,核蛋白（N）主要诱导机体产生细胞免疫,融合蛋白（F）主要诱导机体产生中和抗体。本研究成功克隆了犬瘟热病毒小熊猫株（CDVLP）N蛋白和F蛋白基因全长cDNA,并进行了测序和遗传进化分析。以N蛋白和F蛋白基因作为目的基因分别构建了犬瘟热病毒基因疫苗表达载体pCIN和pCIF,并在MDCK细胞中进行了表达。以含CAV-2SY弱毒株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体分别构建了基于pVAX1载体表达元件的CDV N蛋白重组犬2型腺病毒CAV-2-pVAXLPN和F蛋白重组犬2型腺病毒CAV-2-pVAXLPF。为提高重组病毒的外源蛋白表达量,在构建上述两株重组病毒的基础上构建了基于pCI载体表达元件的重组犬2型腺病毒CAV-2-pCILPF,免疫犬实验表明CAV-2-pCILPF诱导犬产生的抗体效价高于CAV-2-pVAXLPF。将基因疫苗与3株重组腺病毒以不同的组合方式进行了免疫犬实验及攻毒保护实验。免疫动物实验结果表明,基因疫苗和重组腺病毒免疫动物后能引起机体产生体液免疫和细胞免疫应答。而且,重组腺病毒可以通过口服和肌肉注射等多种途径免疫动物,尤其是对于凶猛的野生动物狮、虎、豹等采用含有重组腺病毒的食物进行口服免疫更为方便、有效。以上研究将为研制有效预防犬瘟热的基因疫苗和重组腺病毒活载体疫苗奠定一定基础。

论文目录

• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 犬瘟热病毒研究进展
• 1 CDV的生物学性状
• 2 CDV分子生物学特性
• 3 CDV致病机理和CD的临床症状
• 4 我国CD流行现状及其病原生态学概况
• 第二章 犬瘟热疫苗的研究进展
• 1 常规疫苗的研究进展
• 2 新型疫苗的研究进展
• 第三章 腺病毒载体的研究进展
• 1 腺病毒的分子生物学特性
• 2 腺病毒载体的优缺点
• 3 腺病毒载体的改进
• 4 重组犬腺病毒载体的研究进展
• 第二篇 研究内容
• 第一章 犬瘟热病毒小熊猫株核蛋白和融合蛋白基因克隆及遗传进化分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 N蛋白基因的扩增、克隆及重组质粒pMD18-N的鉴定
• 2.2 F蛋白基因的扩增、克隆及重组质粒pMD18-F的鉴定
• 2.3 N蛋白基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析
• 2.4 F蛋白基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析
• 2.5 N蛋白和F蛋白疏水性、抗原表位和表面极性预测分析
• 3 讨论
• 3.1 大片段目的基因CDVLP株N蛋白和F蛋白基因的RT-PCR扩增
• 3.2 CDV LP株N蛋白和F蛋白基因遗传进化分析
• 4 小结
• 第二章 犬瘟热病毒基因疫苗表达载体的构建及其在真核细胞中的表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 重组真核表达载体pCIN的酶切及PCR鉴定
• 2.2 重组真核表达载体pCIF的酶切及PCR鉴定
• 2.3 重组真核表达载体在MDCK细胞中的瞬间表达及检测
• 3 讨论
• 3.1 关于目的基因的选择
• 3.2 关于基因疫苗真核表达载体的选择
• 3.3 关于基因疫苗表达载体质粒pCIN和pCIF在真核细胞中的表达
• 4 小结
• 第三章 犬瘟热病毒核蛋白重组犬腺病毒的构建与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 犬瘟热病毒核蛋白重组犬腺病毒的构建
• 2.2 犬瘟热病毒核蛋白重组犬腺病毒的鉴定
• 2.3 犬瘟热病毒核蛋白在重组犬腺病毒中表达的检测
• 2.4 重组病毒CAV-2-pVAXLPN的遗传稳定性
• 3 讨论
• 3.1 腺病毒载体系统的选择
• 3.2 穿梭质粒pVAX△E3LPN和重组质粒pCAV-2-pVAXLPN的构建
• 3.3 重组病毒的鉴定及其表达目的蛋白的检测
• 4 小结
• 第四章 基于pVAX1载体表达元件的犬瘟热病毒融合蛋白重组犬腺病毒的构建与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 犬瘟热病毒融合蛋白重组犬腺病毒的构建
• 2.2 犬瘟热病毒融合蛋白重组犬腺病毒的鉴定
• 2.3 犬瘟热病毒融合蛋白在重组犬腺病毒中表达的检测
• 2.4 重组病毒CAV-2-pVAXLPF的遗传稳定性
• 3 讨论
• 3.1 CDV融合蛋白基因（F基因）作为目的基因的选择
• 3.2 CAV-2 E3区的缺失对病毒复制和包装的影响
• 3.3 重组腺病毒的构建方法
• 4 小结
• 第五章 基于pCI载体表达元件的犬瘟热病毒融合蛋白重组犬腺病毒的构建与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 犬瘟热病毒融合蛋白重组犬腺病毒的构建
• 2.2 犬瘟热病毒融合蛋白重组犬腺病毒的鉴定
• 2.3 重组病毒CAV-2-pCILPF中F蛋白表达的检测
• 2.4 利用不同载体表达元件构建的重组病毒中F蛋白表达差异的比较
• 2.5 重组病毒CAV-2-pCILPF的遗传稳定性
• 3 讨论
• 3.1 pCI表达载体的选择
• 3.2 外源基因的表达
• 3.3 阳离子脂质体介导的重组质粒转染真核细胞技术
• 4 小结
• 第六章 犬瘟热病毒基因疫苗与重组犬腺病毒实验免疫研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 免疫小鼠抗CDV抗体检测
• 2.2 免疫小鼠的淋巴细胞转化检测
• 2.3 免疫犬抗CDV抗体检测
• 2.4 免疫犬抗CAV HI抗体检测
• 2.5 免疫犬淋巴细胞转化检测
• 2.6 攻毒保护试验结果
• 3 讨论
• 3.1 免疫动物体液免疫和细胞免疫应答
• 3.2 影响基因疫苗和重组病毒免疫效果的因素
• 3.3 基因疫苗和重组病毒活载体疫苗的安全性及其应用前景
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介