甜菜黑色焦枯病毒的基因功能及表达策略研究

论文题目: 甜菜黑色焦枯病毒的基因功能及表达策略研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 原雪峰

导师: 于嘉林,李大伟

关键词: 甜菜黑色焦枯病毒,突变,基因表达,功能,结构

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本论文以甜菜黑色焦枯病毒（Beet black scorch virus,BBSV）侵染性全长cDNA克隆pUBF52为材料,利用体外转录物的核苷酸（nt）突变和绿色荧光蛋白（GFP）标记等技术,对BBSV不同基因的功能和基因组表达策略开展了反向遗传学研究。通过对编码区核苷酸的替换、移码和缺失突变,证实了位于基因组5′端的P22和P82基因所编码的蛋白是参与BBSV复制酶（RdRp）功能的必需组分。通过翻译起始密码子的点突变和引入提前终止密码子,对由计算机推导而来、位于BBSV基因组中部的4个小分子蛋白编码框（P5、P7a、P7b和P5′）分别进行了功能分析。结果发现,其中对P5编码框的突变没有对BBSV侵染苋色藜（Chenopodium amaranticolor）后的枯斑症状,以及病毒RNA在寄主内的积累水平产生任何影响;而对P7a、P7b或P5′编码框的类似突变改造则将导致BBSV接种苋色藜后的局部枯斑症状消失,且体内病毒RNA的积累水平明显降低。进一步采用GFP替换BBSV外壳蛋白（CP）的标记试验证明,在激光共聚焦显微镜下,对P7a、P7b或P5′中任何一个编码框的突变改造都将导致绿色荧光被局限在单个接种细胞的细胞核内,而野生型BBSV所携带的GFP则可在多个相邻细胞的细胞核及细胞膜中同时得到表达。结合以往关于BBSV CP基因的研究结果,由此确认BBSV基因组可能共计编码6种蛋白质,包括与RdRp相关的P22和P82、协同决定BBSV细胞间运动功能的P7a、P7b和P5′、以及外壳蛋白P24。其中P5′基因是在烟草坏死病毒属（Necrovirus）成员中首次发现。在此基础上,对BBSV多顺反子基因组的表达策略进行了初步研究。以纯化的BBSV双链RNA为模板,经5′-RACE和体外转录物单核苷酸突变确定了BBSV在复制过程中产生的两条亚基因组RNA（Subgenomic RNA,sgRNA）的转录起始位点。结果表明,BBSV的sgRNA1和sgRNA2分别起始于BBSV基因组2209位或2526位的鸟苷酸（G）,其中由sgRNA1可翻译产生P7a、P7b和P5′三种蛋白,并由此决定了BBSV接种苋色藜后的细胞间运动及枯斑症状;而sgRNA2则负责CP的表达,对病毒侵染寄主后的症状及RNA积累水平没有明显影响。对亚基因组转录起始点(G2209或G2526)上、下游共9个核苷酸（2204-2213nt或2521-2530nt）的突变分析表明,起始点上游胞苷酸（C）的突变对亚基因组RNA的转录影响较大,即:C2206的突变将导致sgRNA1的转录灭活,而C2521、C2523、或C2524的突变则导致sgRNA2的转录灭活。计算机推导的BBSV基因组二级结构表明,C2206可以在一个“茎-环”结构中与G2118配对;C2521、C2523和C2524则以同样方式与G2380、G2378和G2377位分别配对。对这些碱基对的突变分析发现,维持他们之间的配对关系对相应亚基因组RNA的转录具有重要的作用。进一步对亚基因组转录启动子的缺失突变研究结果表明,sgRNA2的启动子区域可能位于2339nt-2558nt之间,以一种稳定的多重“茎-环”结构存在。鉴于sgRNA1的上游也存在类似的多重“茎-环”结构,由此推断BBSV亚基因组RNA可能是遵循“提前终止机制”复制产生的。计算机分析发现,BBSV基因组或亚基因组RNA的5′、3′末端之间也存在与其他Necrovirus成员类似的“茎-环”结构,环状区域的核苷酸序列高度保守,并且反向互补。为了认识在这种RNA“茎-环”结构之间可能存在相互作用,我们对其进行了初步地突变分析。结果表明,“茎-环”结构中“环”部核苷酸种类的保守性、以及“茎”部的碱基配对程度对于维持病毒正常复制所必需的RNA结构至关重要。

论文目录:

第一章文献综述

1 植物RNA病毒基因组的结构特征

1.1 病毒的基因

1.2 病毒RNA的非编码功能

1.3 与外壳蛋白的相互作用

1.4 缺陷干扰RNA和卫星

2 植物RNA病毒基因组的基因表达策略

2.1 转录水平的策略

2.2 翻译水平的策略

2.3 翻译后水平的策略

3 甜菜黑色焦枯病毒研究简介

4 本论文研究的目的和意义

第二章材料与方法

1 材料

1.1 毒源及抗血清

1.2 载体和菌种

1.3 酶和化学试剂

1.4 引物设计

2 方法

2.1 常用溶液及培养基

2.2 具体实验所用试剂

2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.4 大肠杆菌感受态细胞的转化

2.5 重组质粒的快速鉴定(Cracking)

2.6 质粒DNA的小量提取

2.7 质粒DNA的大量提取

2.8 DNA片段的回收

2.9 体外转录

2.10 寄主植物的机械接种

2.11 基因枪法转染植物

2.12 植物组织总RNA的提取

2.13 植物材料中病毒双链RNA(dsRNA)的提取

2.14 BBSV的提纯

2.15 反转录PCR(RT-PCR)

2.16 5'RACE

2.17 Northern Blot杂交

2.18 Western Blot杂交

2.19 PI(碘化丙锭)染色

第三章甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)编码蛋白的生物学功能分析

1 甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)P22和P82蛋白的生物学功能分析

1.1 BBSV P22和P82蛋白基因突变体的构建

1.2 P22和P82系列突变体的体外转录、摩擦接种及致病症状观察

1.3 P22和P82蛋白基因的7种突变体的侵染性的分子检测

1.4 P22和P82蛋白是BBSV的复制酶组分

2 甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)P5蛋白的生物学功能分析

2.1 P5突变体的构建

2.2 P5蛋白基因突变体的体外转录、摩擦接种及症状观察

2.3 P5突变体的侵染性的分子检测

2.4 BBSV P5蛋白在病毒致病性中的作用分析

3 甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)P7a、P7b和P5'蛋白的生物学功能分析

3.1 P7a、P7b和P5'突变体的构建

3.2 P7a、P7b和P5'突变体的体外转录、摩擦接种及症状观察

3.3 P7a、P7b和P5'突变体的侵染性的分子检测

3.4 BBSV P7a、P7b和P5'蛋白可能是病毒的运动蛋白

4 甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)P7a、P7b和P5'蛋白是病毒的运动蛋白

4.1 携带GFP的P7a、P7b和P5'蛋白基因突变体的构建

4.2 GFP表达载体接种、症状观察及显微镜观察

4.3 BBSV P7a、P7b和P5'蛋白是病毒的运动蛋白

5 讨论

第四章甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)亚基因组的机制研究

1 BBSV基因组RNA复制过程中产生2条亚基因组

2 BBSV的亚基因组的转录起始位点的定位

2.1 亚基因组RNA1的5'-RACE

2.2 亚基因组RNA2的5'-RACE

2.3 亚基因组RNA可能的转录起始位点

3 BBSV的亚基因组的转录起始位点的定位

3.1 BBSV的亚基因组5'末端核苷酸的点突变体构建

3.2 BBSV的亚基因组5'末端核苷酸的点突变体体外转录、摩擦接种及症状观察

3.3 BBSV的亚基因组5'末端核苷酸的点突变体的分子检测

3.4 结果分析与讨论

4 BBSV的亚基因组启动子区的定位

4.1 BBSV亚基因组1(sgRNA1)的启动子区的定位

4.2 BBSV亚基因组2(sgRNA2)的启动子区的定位

5 亚基因组的转录起始位点周围核苷酸在亚基因组产生中的的作用

5.1 BBSV sgRNA1的转录起始位点周围核苷酸在sgRNA1形成中的作用

5.2 BBSV sgRNA2的转录起始位点附近核苷酸在sgRNA2形成中的作用

5.3 BBSV亚基因组转录位点周围重要核苷酸的精细突变分析

6 讨论

第五章 BBSV基因组RNA的5'、3'RNA-RNA互作分析

1 BBSV基因组和亚基因组RNA5'末端序列高度保守、结构相似

2 BBSV基因组RNA近3'区域存在与5'末端性质互补的结构

3 BBSV基因组、亚基因组5'、3'末端突变体构建

4 BBSV基因组、亚基因组5'、3'末端突变体的体外转录、摩擦接种及症状观察

5 BBSV基因组、亚基因组5'、3'末端突变体分子检测

6 结果分析与讨论

第六章结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

致谢

附录

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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[3].引起葡萄皱木复合症的两种线形病毒的分子特性研究[D]. 王泽琼.华中农业大学2011
[4].李属坏死环斑病毒遗传多样性分析和致病相关基因鉴定[D]. 崔红光.华中农业大学2013
[5].烟草坏死病毒A外壳蛋白的核质穿梭及其功能分析[D]. 牛少芳.中国农业大学2013
[6].芜菁邹缩病毒复制酶小亚基P28在重复侵染排斥中的功能研究[D]. 张晓峰.中国农业大学2013

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