RUNX1对Wnt5a的转录调控及其在造血发育中的作用

论文摘要

RUNX1（runt-related transcription factor 1）是造血发育中关键转录因子之一,在胚胎和成体造血过程都发挥重要作用。在成体造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）分化过程中RUNX1主要参与调控多个HSCs增殖、分化相关基因的表达。RUNX1的缺失抑制巨核细胞的成熟和T、B淋巴细胞的分化,其突变或基因重排与白血病的发生有关。在胚胎造血发育中,RUNX1参与调控血液血管干细胞（hemangioblast）向HSCs分化,敲除Runx1基因导致胚胎背主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephres region, AGM）区血管壁腹侧无造血簇产生,而使永久造血（defenitive hematopoiesis）完全缺失。早期研究发现,Runx1转录产物在不同的发育阶段存在可变剪接现象,剪接位点发生在外显子5（Exon5）处,产生Ex5和ΔEx5两种剪接体,ΔEx5剪接体因缺失外显子5而使其表达产生的蛋白转录激活能力较低。同时,其基因上游存在两个启动子调控Runx1的转录,启动子1（promoter 1,P1）的转录产物Runx1c和启动子2（promoter 2,P2）的转录产物Runx1b在造血发育中有明显的表达差异,但其作用机制尚不清楚。我们的实验以检测Runx1变体在造血发育不同阶段和位点的表达为出发点,阐述RUNX1对造血发育和造血微环境的调控并初步探讨其作用机制。为了研究小鼠造血发育过程中Ex5和ΔEx5两种剪接体的表达差异,分离小鼠E7.5-11.5 （embryonic day 7.5-11.5）不同造血组织AGM区、卵黄囊（yolk sac, YS）,通过RT-PCR检测AGM区和YS在此发育阶段内两种剪接体的表达差异情况。结果表明:E7.5-11.5YSΔEx5表达高于Ex5,但无明显变化趋势;E8.5-11.5AGM区中,ΔEx5 E8.5表达占优势,Ex5剪接体表达则逐渐升高。这说明胚胎造血发育过程中RUNX1对造血细胞的调控功能可能主要由转录激活功能较强的Ex5剪接体实现。RT-PCR检测E7.5-11.5时AGM区Runx1b和Runx1c表达发现,在此发育过程中Runx1b表达较高;E11.5胚胎不同造血部位AGM区、YS、胎盘（placenta,PL）、胎肝（fetal liver,FL）以及成体骨髓（bone marrow,BM）,RT-PCR结果显示:E11.5胚胎AGM区Runx1b表达高于Runx1c,而在FL中Runx1c表达较高。分离成体小鼠骨髓贴壁细胞和悬浮的造血细胞,RT-PCR结果表明,贴壁细胞Runx1b表达高于Runx1c。由于小鼠骨髓贴壁细胞种类较复杂,我们通过进一步培养获得MSCs（mesenchymal stem cells,MSCs）,结果发现:小鼠BM MSCs中Runx1b表达较高。上述结果说明:Runx1c主要在FL和成体的造血细胞表达,可能与HSCs的分化有关;而Runx1b在早期造血细胞和基质细胞中表达较高,暗示Runx1b除了直接调控早期造血发育外,还可能通过对造血微环境的调节而间接调控造血发育。MSCs最早在BM中发现,具有多向分化能力,体外特定条件下可分化产生脂肪、成骨及软骨细胞。MSCs是骨髓造血微环境的重要组成部分,可以通过分化为成骨细胞和脂肪细胞或分泌多种细胞因子调节造血细胞的增殖和分化。在造血细胞中,RUNX1通过调节下游基因的转录活性对造血发育进行调控,但RUNX1在MSCs中的调控效应尚不明确。为检测RUNX1在小鼠BM MSCs中的作用,探讨RUNX1对造血微环境的调节机制,我们首先利用启动子分析软件,发现Wnt5a和Runx2可能为RUNX1的下游靶基因。为了对预测结果进行验证,通过染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验研究Wnt5a、Runx2与RUNX1在体内的相互作用关系,结果发现RUNX1可与Wnt5a启动子区直接结合,而不能与Runx2启动子结合。为了进一步研究RUNX1与Wnt5a转录调控关系,从小鼠BM MSCs中克隆表达较高的Runx1b,利用逆转录病毒系统使Runx1b在MSCs内高表达,验证小鼠BM MSCs中RUNX1b对Wnt5a的调控作用。结果发现,Wnt5a的表达随RUNX1b表达升高而增强,这说明在小鼠BM MSCs中,Wnt5a是RUNX1b直接的下游靶基因。WNT5A（wingless-type MMTV integration site family, member 5A）是WNT家族的重要成员,主要参与WNT/Ca+信号通路。早期研究发现WNT5A可明显促进HSCs的扩增,并能产生表型更原始、功能更强的子代细胞。我们的实验发现在小鼠BM MSCs脂肪分化体系中加入WNT5A细胞因子,MSCs脂肪分化受到明显抑制,脂肪细胞特异表达产物Adipsin表达降低。为了检测WNT5A对早期造血发育的影响,我们借助BL-CFC（blast colony-forming cell）模型,在BL-CFC培养体系中加入WNT5A细胞因子。BL-CFC在体外代表血液血管干细胞,可以向造血和内皮细胞分化。结果表明,WNT5A可促进BL-CFC集落的形成,并且集落的体积明显增大。体外成血管实验表明,WNT5A可促进BL-CFC的内皮分化,这说明WNT5A不但可以对MSCs自身发育起调控作用,还可以通过旁分泌的方式,调节早期的造血发育。总之,本研究发现,Runx1不同剪接体在小鼠造血发育不同阶段和位点存在表达差异;小鼠BM MSCs高表达Runx1b,RUNX1通过促进Wnt5a的转录抑制MSCs的脂肪分化能力。同时我们的实验发现BL-CFC培养体系中加入WNT5A可以促进BL-CFC的内皮分化。这提示我们早期造血发育过程中,微环境内的MSCs可能通过旁分泌的方式产生WNT5A,对早期造血发育进行调控。为下一步更深入研究RUNX1对造血发育的调控机制奠定基础。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分：RUNX1 在小鼠造血发育中的表达
• 实验流程
• 材料与方法
• 实验结果
• 小结
• 第二部分：小鼠间充质干细胞内RUNX1 对Wnt5a 的转录调控
• 实验流程
• 材料与方法
• 实验结果
• 小结
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录
• 文献综述
• 参考文献
• 论著
• 个人简历
• 致谢