前列腺素E1对损伤血管内皮细胞的保护作用及其机制探讨

论文摘要

血管内皮病变是心血管疾病发生的关键环节,氧化应激和炎症损伤是引起血管内皮损伤的两大主要原因。前列腺素E1（Prostaglandin E1, PGE1）是一种具有广泛生物活性的内源性物质,是多不饱和脂肪酸二高γ-亚油脂酸（DGLA）的氧化产物。PGE1具有舒张血管、抑制血小板聚集、促进血管新生和降低血液粘度的作用。临床上广泛用于冠状动脉粥样硬化性心脏病、心力衰竭、脑梗死、肺心病、肺动脉高压、糖尿病并发症、肾病等的治疗。现在越来越多的研究开始探索PGE1的抗炎抗氧化和血管内皮保护作用。PGE1可以保护人视网膜色素上皮细胞避免氧化损伤,抑制甲氨蝶呤处理大鼠肠粘膜上皮细胞产生活性氧（ROS）,降低外周血管疾病、外周动脉硬化症和肝缺血再灌注损伤患者血液循环中的可溶性黏附分子。但是,还没有直接证据证明PGE1对损伤的内皮细胞具有保护作用。本实验分别采用过氧化氢（H2O2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为外源性自由基和炎症因子生成系统,模拟人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的脂质过氧化损伤和炎症损伤过程,建立离体培养的HUVECs氧化损伤和炎症损伤模型,观察PGE1对氧化损伤和炎症损伤的HUVECs的保护作用,并探讨其可能机制,为其用于心、脑血管疾病的治疗提供药理学依据。我们首先探讨PGE1对氧化损伤HUVECs的保护作用,发现：（1）H2O2（200μM）能显著降低HUVECs细胞的活力,诱导细胞凋亡,可作为体外模型模拟氧自由基致HUVECs细胞氧化应激损伤；（2）PGE1可显著增高H2O2损伤的HUVECs的细胞活力,抑制细胞内LDH释放；（3）PGE1能够启动HUVECs细胞内抗氧化防御机制,显著减少MDA的生成量,提高细胞内SOD的活性和GSH-Px的含量,清除细胞内的ROS；（4）PGE1对H2O2诱导的HUVECs细胞凋亡有明显抑制作用,可抑制凋亡细胞染色质形态学的变化,降低细胞凋亡率；（5）PGE1可提高H2O2损伤的HUVECs细胞的NO水平、eNOS mRNA和蛋白质的水平。由此可见,PGE1能够保护H2O2损伤的血管内皮细胞,NO途径在该过程中发挥重要作用。我们接着探讨PGE1对炎症损伤HUVECs细胞的保护作用,发现：（1）TNF-a （10ng/ml）能显著降低HUVECs细胞的活力,明显上调黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的产生,增加其与单核细胞的黏附能力,可作为体外模型模拟炎症反应致内皮细胞炎症损伤；（2）PGE1浓度依赖性地降低损伤的HUVECs表面ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表达,降低单核-内皮细胞之间的黏附作用,从而阻止继发的炎症反应；（3）PGE1可明显抑制TNF-α诱导的NF-kB （p65）活化,这可能是PGE1抑制TNF-α诱导的内皮细胞损伤的原因之一；（4）PGE1抑制TNF-α诱导的细胞内ROS表达,这也可能是PGE1抑制TNF-α诱导的内皮细胞损伤的原因之一。由此可见,PGE1能够保护TNF-α损伤的HUVECs,这与其抑制TNF-α诱导的NF-kB （p65）活化和ROS产生。综上所述,PGE1对氧化损伤和炎症损伤的HUVECs具有保护作用,这为PGE1治疗血管内皮损伤性疾病如动脉粥样硬化、心绞痛、心肌梗死、弥散性血管内凝血等提供药理学证据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 前言
• 1对H₂O₂诱导的血管内皮细胞氧化损伤的保护作用'>第一部分 前列腺素E₁对H₂O₂诱导的血管内皮细胞氧化损伤的保护作用
• 一、实验材料
• （一） 药品及试剂
• （二） 主要仪器
• （三） 细胞
• 二、实验方法
• （一） 细胞培养及分组
• 1 细胞培养
• 2 氧化损伤模型的建立
• 3 细胞分组及处理
• （二） 实验项目及检测指标
• 1 细胞活性的测定
• 1.1 MTT法检测细胞活力
• 1.2 上清中LDH含量测定
• 2 细胞内氧化-抗氧化能力的测定
• 2.1 酶生化法测定MDA含量、GSH-Px和SOD活力
• 2.1.1 丙二醛（MDA）含量测定
• 2.1.2 超氧化物歧化酶（SOD）活力测定
• 2.1.3 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力测定
• 2.2 流式细胞仪测细胞内活性氧
• 3 细胞凋亡的测定
• 3.1 Hoechst 33258/PI荧光染色法观察细胞核形态
• 3.2 流式细胞术检测细胞凋亡率
• 4 一氧化氮（NO）的测定
• 4.1 上清液中NO含量的测定
• 4.2 Western blotting法测定eNOS蛋白表达
• 4.3 Realtime PCR法测定eNOS mRNA表达
• （三） 数据处理
• 三、实验结果
• （一） 氧化损伤模型的建立
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞活性的影响'>（二） PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞活性的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞生存率的影响'>1 PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞生存率的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞LDH释放率的影响'>2 PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞LDH释放率的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞产生自由基的影响'>（三） PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞产生自由基的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞MDA含量、SOD和GSH-Px活力的影响'>1 PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞MDA含量、SOD和GSH-Px活力的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞内SOD活力的影响'>1.1 PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞内SOD活力的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞内GSH-Px含量的影响'>1.2 PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞内GSH-Px含量的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞内MDA含量的影响'>1.3 PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞内MDA含量的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞内ROS荧光强度的影响'>2 PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞内ROS荧光强度的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞凋亡的影响'>（四） PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞凋亡的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞染色质的影响'>1 PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞染色质的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞凋亡率的影响'>2 PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞凋亡率的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞产生NO的影响'>（五） PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞产生NO的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞产生NO的影响'>1 PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞产生NO的影响
• 1对H₂O₂损伤HUVECs细胞eNOS蛋白质和mRNA水平的影响'>2 PGE₁对H₂O₂损伤HUVECs细胞eNOS蛋白质和mRNA水平的影响
• 四、讨论
• 五、小结
• 1对TNF-α诱导的血管内皮细胞炎症损伤的保护作用'>第二部分 前列腺素E₁对TNF-α诱导的血管内皮细胞炎症损伤的保护作用
• 一、实验材料
• （一） 药品及试剂
• （二） 主要仪器
• （三） 细胞
• 二、实验方法
• （一） 细胞培养及分组
• 1. 细胞培养
• 2. 炎症损伤模型的建立
• 3. 细胞分组及处理
• （二） 实验项目及检测指标
• 1. MTT法检测细胞活力
• 2. ELISA法测定细胞膜表面黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的表达
• 3. RT-PCR法测定ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的mRNA表达
• 4. 单核-内皮细胞黏附实验
• 5. 细胞内ROS的测定
• 6. Western blotting法测定胞质和胞核NF-κB（p65）蛋白表达
• （三） 数据处理
• 三、实验结果
• （一） 炎症损伤模型的建立
• 1对TNF-α损伤HUVEC细胞活性的影响'>（二） PGE₁对TNF-α损伤HUVEC细胞活性的影响
• 1对TNF-α损伤内皮细胞表面VCAM-1,ICAM-1和E-selectin表达的影响'>（三） PGE₁对TNF-α损伤内皮细胞表面VCAM-1,ICAM-1和E-selectin表达的影响
• 1对单核THP-1细胞与TNF-α诱导的HUVEC的黏附影响'>（四） PGE₁对单核THP-1细胞与TNF-α诱导的HUVEC的黏附影响
• 1对TNF-α损伤HUVECs细胞内ROS荧光强度的影响'>（五） PGE₁对TNF-α损伤HUVECs细胞内ROS荧光强度的影响
• 1对TNF-α诱导的HUVEC细胞中NF-κB（p65）核转位的影响'>（六） PGE₁对TNF-α诱导的HUVEC细胞中NF-κB（p65）核转位的影响
• 四、讨论
• 五、小结
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位论文期间发表的论文
• 文献综述
• 学位论文评阅及答辩情况表