银杏苯丙氨酸解氨酶基因克隆及基因家族分析

论文摘要

银杏又名白果、公孙树、.鸭脚子、鸭掌树,是新生代第四纪冰川期的孑遗植物,为我国独存的珍稀名贵树种。银杏叶提取物（GBE）具有促进血液循环,改善心血管功能,清除体内超氧离子,预防肿瘤等作用,特别是在治疗和预防心脑血管系统疾病方面具有重要的作用,银杏的开发和研究已经成为整个人类共同努力的课题。银杏制剂的质量主要取决于银杏叶的质量,不同产区的银杏叶功能活性成分含量差距较大,说明药用银杏品种的选择与银杏制剂的质量有着直接联系。通过先进的基因工程技术有目的性的培育高产银杏药用品种已经成为开发银杏资源的一种重要途径。而进行基因改造的前提是要充分了解有效成分的代谢途径中的关键酶基因和起主要调控物质的基因,而克隆关键酶基因是首要任务之一。本研究通过分子生物学技术对银杏黄酮类活性成分代谢途径中的第一个关键限速酶苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase, PAL）进行了较为系统的分子生物学研究：对银杏基因组进行酶切、连接接头、特异PCR扩增,运用基因步移技术,对银杏PAL基因侧翼序列进行了克隆,获得长度为588 bp的基因片段,通过在线比对鉴定为PAL基因的一部分,所得序列已登录在NCBI的GenBank中,核酸序列Accession number为EU713843。利用先进的生物信息学分析方法和丰富的银杏EST数据资源,初步建立了较完整和系统的利用EST资源挖掘新基因的方法,通过对EST序列的比对、筛选、祛除冗余、拼接和聚类得到了2条银杏PAL基因家族新成员的电子克隆片段。并设计了特异PCR引物,通过PCR扩增验证了电子克隆片段的真实存在性。证实了2条银杏PAL新成员真实存在于银杏基因组中,并为进一步开展银杏PAL基因家族研究奠定了一定的实验基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究目的和意义
• 1.3 研究目标
• 1.4 研究内容
• 1.4.1 银杏PAL基因全长克隆
• 1.4.2 银杏PAL基因家族成员的电子克隆
• 1.4.3 银杏PAL基因家族成员聚类分析
• 1.4.4 PAL基因家族成员的PCR扩增验证
• 1.5 研究技术路线图
• 2 银杏PAL基因下游基因片段克隆
• 2.1 基因克隆
• 2.1.1 基于PCR的基因克隆
• 2.1.2 基因组步移克隆
• 2.2 银杏PAL基因下游片段克隆
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.2 实验结果
• 2.2.3 小结与讨论
• 3 银杏EST分析和电子克隆
• 3.1 实验原理
• 3.1.1 EST序列
• 3.1.2 EST分析和电子克隆原理
• 3.2 资源、方法与结果
• 3.2.1 数据来源
• 3.2.2 Blast方法与结果
• 3.3 小结与讨论
• 4 电子克隆银杏PAL新成员验证
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 银杏总DNA电泳检测结果
• 4.2.2 PCR扩增结果检测
• 4.2.3 PCR扩增结果分析
• 4.3 小结与讨论
• 5 总结与展望
• 参考文献
• 文献综述
• 1 黄酮类物质代谢途径
• 2 PAL研究现状
• 3 克隆新基因方法
• 4 基因家族研究策略
• 5 PCR技术介绍
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 公开发表的学术论文、专著及科研成果